DNA提取主要是CTAB方法,其他的方法還有物理方式如玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法。化學方式如異硫氰酸胍法、堿裂解法。生物方式:酶法。根據核酸分離純化方式的不同有;矽質材料、陰離子交換樹脂等。
提取DNA總的原則:
1.保證核酸壹級結構的完整性;
2.核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子;
3.其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的汙染應降低到最低程度;
4.其他核酸分子,如RNA,也應盡量去除。
例如 : 用酶法提取
DNA提取分為三個基本步驟,每個步驟的具體方法可根據樣品種類、影響提取的物質以及後續步驟的不同而有區別。
工具/原料: 研磨棒、研磨儀或者組織破碎儀 , 氯仿:異戊醇(24:1)或者蛋白酶 , RNA酶 , ?酒精 , 冰箱
方法/步驟 :?
使用研磨儀、研磨棒或者使用超聲破碎細胞的方法破碎細胞,加入去汙劑,如sds等,除去膜脂。
去除細胞內的蛋白質,包括與DNA結合的組蛋白,通過加入蛋白酶,醋酸鹽沈澱,或者酚/氯仿抽提等方法去除。
加入RNA酶去除RNA,如實驗不嚴密,可省略此步。
沈澱DNA,需在冷乙醇或異丙醇中沈澱,放在冰箱-20℃沈澱30分鐘以上,原理是DNA在醇中不可溶而黏在壹起發生沈澱。
總結: DNA提取方法有下面⑦種
壹.酚抽提法:先用蛋酶K、SDS破碎細胞,消化蛋白,然後用酚和酚-氯DNA大小為100-150kb
二.甲酰胺解聚法:破碎細胞同上,然後用高濃度甲酰胺解聚蛋白質與DNA的結合,再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。
三.玻璃棒纏繞法:用鹽酸胍裂解細胞,將裂解物鋪於乙醇上,然後用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪,DNA沈澱液繞於玻棒。生成DNA約80kb。
四.異丙醇沈澱法:基本同1法,僅用二倍容積異丙醇替代乙醇,可去除小分子RNA(在異丙醇中可溶狀態)
五.表面活性劑快速制備法:用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞,然後用蛋白酶K或酚去除蛋白,乙醇沈澱或透析。
六.加熱法快速制備:加熱96℃-100℃,五分鐘,然後離心後取上清,可用於PCR反應。
七.堿變性快速制備:先用NaOH作用20分鐘,再加HCI中和,離心後取上清,含少量DNA。