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western blot實驗步驟

western blot實驗操作步驟如下:

1.?準備樣品

1)制冰,準備冰盒。

2)配制細胞裂解液:根據細胞數量確定所需裂解液:50ul/六孔板壹孔 。

裂解液配方:100ul碧雲天裂解液+1ul蛋白酶抑制劑混合物+1ul PMSF

3)按實驗需要準備好細胞:去掉培養基,1×PBS洗3次(去掉培養基中的血清),每個孔(6孔板)加入適量的裂解液。迅速用細胞刮刮下細胞並轉移至1.5ml管中,置於冰上20min,振蕩混合後,再置冰上10min。

2.?SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳:制備分離膠(5ml/gel)

3.?膜轉移

1) 切膠,按Marker指示和目的條帶的位置切膠(註意將膠切角做記號),將洗脫的膠浸入轉膜緩沖液中15分鐘。

2) PVDF膜做好記號後先浸入甲醇中1分鐘,再連同4張3mm濾紙和海綿浸入轉移緩沖液中15分鐘。