1.PCR擴增克隆法
PCR擴增克隆法是在已知植物基因序列的基礎上,進行基因序列克隆的壹種方法。先從基因文庫(genebank)中找到有關基因序列,據此合成壹對寡聚核苷酸引物,從植物中提取染色體DNA或RNA,進行PCR擴增。擴增的片段純化後插入合適的質粒載體上,用酶切分析和序列分析檢測重組子,並與已知基因序列比較,以獲得目的基因。
2.功能克隆法
功能克隆(functionalcloning)是根據性狀的基本生化特征,在鑒定已知基因功能後進行克隆。該法在純化相應的編碼蛋白質後,構建cDNA文庫或基因組文庫。然後從文庫中用下述兩種方法進行基因篩選,其壹是將純化的蛋白質進行氨基酸測序,據此合成寡核苷酸探針,從cDNA文庫或基因組文庫中篩選編碼基因;其二是將編碼蛋白質制成相應抗體探針,從cDNA載體表達文庫中篩選相應克隆。實行功能克隆的關鍵步驟是分離出高純度蛋白質。對於產物不明的基因,不能利用這壹方法進行克隆。
3.定位(圖位)克隆法
定位(圖位)克隆法(positionalcloning)根據目的基因在染色體上的位置,進而通過染色體步移(chromosomewalking)進行克隆。需預先建立具有目的基因的適宜遺傳分離群體(近等基因系或分離群體),將目的基因精確定位在染色體特定的位置之後,用目的基因兩側緊密連鎖的分子標記(RFLP標記)為探針,篩選基因組文庫,得到陽性克隆,然後以陽性克隆的末端作為探針,獲得含有目標基因的大片段克隆,然後以這些新的DNA為探針,獲得更趨近目的基因的DNA片段,不斷縮小篩選區域,逐步向目的基因靠近,最終克隆到該基因。
4.轉座子標記法
轉座子(transposon)是可從壹個基因位置轉移到另壹位置的DNA片段,而原來位置的DNA片段(轉座子)並未消失,發生轉移的只是轉座子的拷貝。基因轉座可引起插入突變,使插入位置的基因失活,並誘導產生突變型。通過標記基因就可以檢測出突變基因的位置,進而克隆該突變基因。這樣將轉座子作為基因定位的標記,並通過轉座子在染色體上的插入和嵌合來克隆基因稱為轉座子標記法(transposontagging)。para>5.減法雜交法
該法根據植物表現型差異或基因在不同組織或器官的表達差異來克隆植物基因。特異性表達的基因,其mRNA表現不同。分別從表達特異性基因的植物組織和無特異性基因的組織中提取mRNA,反轉錄為cDNA,兩者雜交。在兩種組織中都表達的基因產物形成雜交分子,而特異mRNA轉錄的cDNA仍保持單鏈狀態,將這種單鏈cDNA分離出來即為差異表達的基因,這壹策略被稱作減法雜。
6.mRNA差異顯示法
該法可有效鑒別並克隆差異表達的基因。提取不同的mRNA後可用***同的引物反轉錄成cDNA,進行PCR擴增,獲得差異表達的cDNA序列,作為探針,在cDNA文庫或基因組文庫中篩選基因,並作功能分析。該法可直觀篩選差異表達的基因,比減法雜交操作方便、迅速,需要總RNA量少,效率高,短期內可完成cDNA的擴增、鑒定和克隆。