材料和方法（筆記)：
1：細胞培養：B16F10和CD8T細胞
2.轉染：
①慢病毒Cas9-Blast載體（具有殺稻瘟菌素抗性）與質粒pCMV-dR8.91和pCMV-VSV-G包裝後***轉染進入HEK293T細胞
②Cas9-Blast慢病毒感染B16F10細胞並用殺稻瘟菌素篩選得到B16F10-Cas細胞
目的：為了獲得高Cas9活性的克隆
B16F10-Cas細胞以單細胞分選入96孔板並用慢病毒感染，驅動Cd274和熒光探針特異性的gRNA的表達。感染10天後，將每個單獨的克隆用γIFN刺激，並使用抗-CD274抗體通過FACS測定PD-L1的表達。通過測量轉導的（mCherry）群體中PD-L1陰性細胞的百分比來評估Cas9編輯效率。
3.CD8T細胞分離和體外活化
使用試劑盒從Pmel-1和OT-I TCR轉基因小鼠中分離CD8T細胞並用抗CD3/CD28玻璃珠刺激新鮮分離的CDT細胞，3天後加入IL-2，6天後將活化的CD8T細胞與B16F10細胞***培養。
Pmel-1轉基因小鼠：該轉基因株攜帶重排的T細胞受體轉基因，該轉基因特異於人SILV（gp100）的小鼠同源物（pmel-17），這是壹種由大多數惡性黑素瘤細胞（包括B16黑素瘤）以及正常黑色素細胞表達的參與色素合成的酶。在該小鼠中分離得到 CD8 + T細胞表達Tcra-V1 / Tcrb-V13-轉基因TCR，其識別pmel-17表位對應的由H2-Db MHC I類分子提成的gp100的氨基酸25-33。
OT-I T轉基因小鼠：該小鼠含有用於小鼠Tcra-V2和Tcrb-V5基因的轉基因插入物。設計的轉基因T細胞受體在H2Kb（CD8***受體與MHC I類相互作用）的情況下識別卵清蛋白肽殘基257-264（OVA257-264）。這導致MHC I類限制性卵清蛋白特異性CD8 + T細胞（OT-I細胞）。也就是說，當由MHC I分子呈遞時，該小鼠的CD8 T細胞主要識別OVA257-264。這些小鼠通常用於研究CD8 + T細胞對抗原的反應，陽性選擇，以及任何需要具有確定特異性的CD8 + T細胞的研究。
CD3/CD28的作用是刺激從轉基因小鼠中分離的CD8+T細胞增殖活化，IL-2的作用是使CD8+T細胞生長並增強T細胞的殺傷活性。