鑒於T—A2易溶於水、丙酮水溶液，在甲醇、乙醇等有機溶劑中能溶解的特性_9 J，可采用溶劑萃取法從發酵液中提取T—A2。Bardone[ J等曾首次采用非水溶性有機溶劑如氯化的C1壹C4碳氫化合物或C4壹C6鏈烷醇萃取T—A2。發酵液先過濾，濾液用l0％的鹽酸(加少量氯化鈉)調pH至3．5後用丁醇萃取，再經
高速離心、濃縮、冷卻沈澱得粗品。其菌絲先水洗，用10％的鹽酸調pH為3．5，再用丙酮水溶液(8：2)提取，蒸去丙酮，維持pI-I3．5不變。再經丁醇萃取，離心、濃縮、冷卻沈澱出粗品。合並粗品，經HPLC及微生物檢定法檢測純度為64．8％。另有專利報道了稍加改進的提取方法。即用水溶性有機溶劑如丙酮、乙腈、正丙醇、甲基乙基酮、二甲亞碸等直接加入到酸化的發酵液中(pH=3～4)，聚集T—A2，經離心或過濾除去菌絲體，其溶液部分再經濃縮、冷卻，沈澱出T—A2粗品。收率達64．5％ ～88．7％。該法與上述兩步法相比，操作簡單，且提高了收率。
2 吸附法
T—A’抑菌的作用原理是它與細胞壁粘肽合成的前體UDP—N壹乙酰胞壁酰壹L壹丙氨酰壹 壹D壹谷氨酰壹L壹賴氨酰壹D壹丙氨酰壹D壹丙氨酸(UDP壹五肽)末端，即D—Ala—D—Ala的遊離羧基緊密結合，形成T—A2和N、N 壹二乙酰基壹L壹賴氨酰壹。
壹丙氨酰壹D壹丙氨酸的復合物，幹擾了細胞壁的正常合成，從而抑制了細菌的生長。而且實驗證明T—A2對以D—Ala—D—A1a為末端的肽有高度的親和性(Ka=1．5×106)?J。根據這壹作用機制，通過將二肽D—Ala—D—Ala或多肽X—D—Ala—D—Ala(×為氨基酸殘基)連接於載體上制成有生物選擇性的親和介質，能有效地進行分離純化T—A2。其親和載體可采用瓊脂、葡聚糖、纖維素、聚苯乙烯或丙烯酸系***聚物等大分子物質，通過交聯反應，與D～Ala～D—Ala或X—D—Ala—D—Ala相連形成親和介質。也可將帶有“手臂”(如6壹氨基己酸，N壹羥基琥珀酰亞胺或脂肪酸鏈)的載體與上述肽段相連形成親和介質，直接
將發酵液裝入有此類親和介質的層析柱。實驗表明此法能有效地分離純化糖肽類抗生素，尤其是T—A2及T壹 的衍生物Corti等曾運用Sepharos 4B— D—Ala—D—Ala直接由發酵液純化得到T壹 。上柱後經堿性緩沖液解吸，可以得到純度約94％ 的T
— A，，收率達65％ 。並且此親和介質也已被成功用於尿和血漿中T—A2的濃縮和純化。Folena—Wasser—man等運用Afi—Gel 10壹D—Aa—D—Ala純化T壹 ，也取得了好的效果。
解吸液可采用堿性緩沖液如pH9．5 0．4mol／LNaHco3(含乙腈)、pH9 0．25mol／L NaHC~) (含乙腈)、pHll 0．1mol／L．氨水(50％ 乙腈)，或pHIl0．15mol／L NaCI磷酸緩沖溶液。實驗證明pH在10～ l1．5範圍內的解吸劑效果較好，其解吸率可達97％以上。由於發酵液中雜質多，如直接上柱，久之必然汙染色譜柱，因此上柱前可將發酵液先經過初步分離，如過濾、萃取、沈澱等過程，不僅會增加色譜柱的使用壽命也會提高其吸附效果。利用分子吸附原理采用聚酰胺樹脂也已被證明能很好地分離純化T—A2。發酵液經初步純化後調至pH5 8，上聚酰胺(CC壹6、SC壹6、cc6Ac、sc6Ac)樹脂柱，用甲醇水溶液(9：1)洗脫，洗脫液蒸去甲醇，加入丙酮，降溫沈澱出T—A2或在低溫下(5℃)調pH至等電點沈澱出該物質，純度為85．7％。另外在發酵液初步純化時，如果在pH 10．5～11的情況下分離菌絲體，至少90％的產品進入濾液，因此僅此壹步就能使替考拉
寧純化過程總收率提高50％。
3 離子交換法
從T壹 的化學結構看：它有壹個氨基和壹個羧基，屬兩性化合物。因此可用離子交換樹脂提取。最早采用陽離子交換樹脂(IR120或Dowex50)作純化載體。後有專利報道，采用聚苯乙烯二乙烯苯磺酸鈉DOW [XFS壹43278．002]強酸鈉鹽樹脂純化T—A2。將樹脂放入發酵液中，室溫下攪拌6h，水洗飽和後的樹脂，再把樹脂放入pill0．5的氫氧化鈉溶液中，維持pH不變，攪拌2h，濾除樹脂，再經脫鹽、濃縮可制得T— A2成品。因為使用酸性離子交換樹脂會增加T—A2糖基部分的降解，強堿性離子交換樹脂卻易增加T—A2的差向異構化，且離子交換樹脂因選擇性較差也不能有效地用於純化T—A2，因此該法的應用前景不被看好，見諸報道者寥寥。
4 液相色譜法
液相色譜法是壹種分離和鑒定化合物的有效方法。它能高效分離純化很復雜的混合物。Borghij等曾利用反相高效液相色譜把由紙色譜和薄層色譜法得到的T—A2成功分離，得到T—A2壹l～T—A2—5五個單壹組分。其過程如下：將溶劑萃取法或其它方法得到的T—A2溶解在0．2％ 甲酸銨壹乙腈(9：1)中，用
lmol／L NaOH調pH7．5，通入制備HPLC柱(矽烷化的矽膠柱)，用10％～20％乙腈和0．2％甲酸銨混合溶液線性梯度洗脫，分步收集，經HPLC分析鑒定，合並其HPLC分布相似的溶液，減壓濃縮除去有機溶劑。濃縮液再上制備HPLC，用50％乙腈洗脫，濃縮洗脫液後，加入丙酮壹乙醚(1：1)可沈澱出T—A2壹l和T—
A'2。T～A2 、T—A2 4和T—A2 可通過半制備HPLC(Whatman Partisil ODS M壹9)，用0．2％甲酸銨壹乙腈(76：24)解吸，再經脫鹽，沈澱可得單壹組分。Cometti等也曾利用低壓制備液相色譜(Jobin—Yron柱)純化T—A2(流動相CI43CN／NaI-'I2PO4(27／23))。張麗華等采用模擬移動床色譜技術對替考拉寧的提純條件進行了研究，取得了良好的效果。但目前該法還處於實驗室階段。另外，據韓國資料報道，目前韓國正是采用溶劑法和HPLC相結合的方法純化T—A2，其收率約65％。
參考文獻---替考拉寧提煉工藝的研究進展--王增霞 吳明 蔣寧