當今二代測序儀器中應用最為廣泛的當屬illumina公司的測序儀，以Hiseq-2000測序儀為例，其有2個流動槽（flowcell），每個flowcell有8條lane（通道），而單就其壹條lane的測序數據量就可達44G。
然而對於目前的外顯子組測序來說，測序區域大約64M，測序深度200X，總數據量也才13G，Hiseq-2000的壹個lane就足以測定3個外顯子組樣品。以轉錄組來說，壹個樣品測序量不會超過4G，壹個lane可以同時測定10個轉錄組樣品。大體而言，外顯子組測序、轉錄組測序、miRNA測序、lncRNA測序、ChIP測序等組數據，每個樣品所需的數據量通常都比較少。
測序數據的單位
核酸序列數據是以“A、T、G、C”堿基順序表示，而其數量的大小可以使用k、M、G等單位來表示，k代表10 3 、M代表10 6 、G代表10 9 ，例如，人全基因組大小為3G（或3Gb），也就是3X10 9 b。 此外，計算機的存儲單位也是使用k、M、G等單位來表示的，不過計算機的存儲單位的換算為1024進位，不同於堿基序列的1000進位。考慮到壹個字母在計算機內存儲為1Byte，因此粗略使用時，測序數據量可以近似等於其占用計算機的大小。
由於測序儀器的測序能力遠大於測試樣本序列量，為避免儀器浪費，因此壹個lane同時測定多個樣品成為很自然的思路。然而為了區分多種樣品的序列，就必須要給不同樣品加上特定的“標簽”，從而可以在後續數據分析時將不同樣品數據分開，而這個“標簽”就是barcode。
簡言之，barcode就是測序中混合樣品的”身份證“，用於區分不同樣品。
下圖來自文獻《 Multiplexed Illumina sequencing libraries from picogram quantities of DNA 》
對於illumina的hiseq平臺而言，測序前，我們需要建庫。
barcode的選擇有兩個原則：堿基平衡和激光平衡。
堿基平衡是指的需要兼顧barcode序列的平衡度與復雜度，平衡度是指的堿基的比例是均衡的（1:1是最均衡的），而復雜度是指的堿基的種類是多樣的（四種堿基同時存在是最多樣的）。
所以最好的barcode序列應該是同時有A、T、G、C四種堿基，且各堿基所占比例近似均為25%。
此處所說的堿基平衡是指的多個barcode之間的平衡，並非壹個barcode內部的堿基平衡。舉例來說，有12個轉錄組樣品需要測定，那麽就需要12個barcode（假定每個barcode長度為6位），根據堿基平衡原則，第壹位barcode堿基應該盡量同時存在A、T、G、C四種堿基，且各堿基所占比例近似均為25%，也就是這12個barcode序列最佳情況應該是以A、T、G、C開頭各3個。剩余5個堿基位的barcode以此類推。
在illumina測序儀中，A和C兩種堿基***用壹種激光，由波長660nm的紅激光激發；G和T***用壹種激光，由波長532 nm的綠激光激發。因此假使不能滿足堿基平衡的情況下，可以退而求其次，盡量滿足激光平衡。
簡單來說，激光平衡就是盡量在使用的壹組barcode中滿足每個堿基位都是A+C=G+T。
既不滿足堿基平衡，又不滿足激光平衡的barcode將會有很大的數據分離隱患，或者無法分離開樣品，或者無法識別某些測序片段。
Illumina推薦的12個barcode序列詳列如下。
以其中的第壹個位置為例（縱列），A:G:C:T=3:3:3:3=1:1:1:1。實際上，該barcode組合每個位置的堿基比例都接近1:1（具體見下表），堿基平衡度接近完美。
位置 1st 2nd 3rd 4th 5th 6th
A 3 3 4 3 3 3
T 3 3 3 3 4 3
C 3 3 3 3 2 3
G 3 3 2 3 3 3
樣本數少於4種，必然無法滿足堿基平衡，怎麽辦
如果樣本數少於4種，則barcode每壹個位置的堿基最多只有3種，不可能做到堿基平衡，怎麽辦呢？這時壹定要盡量保證激光平衡，切不可在同壹barcode位放置同壹種熒光堿基，甚至是同壹種堿基。
當然Illumina也提供了這種情況的解決方案，他們推薦的low-level pooling的barcode組合有3種，序列如下：
2重組合
3重組合
6重組合
這3種barcode組合包含有壹個***同的內核：6號barcode和12號barcode。6號和12號組合是百分百激光平衡的，其每壹個位置（縱列，即GC、CT、CT、AG、AT和TA）都分別屬於不同的激光。也就是說，只要barcode組合中包含6號和12號，就能滿足最基本的de-multiplexing要求，不至於數據完全失誤。
除了illumina推薦的12個barcode，還有康奈爾大學的96個針對ApekⅠ酶建庫的barcode，華中農業大學的96個針對MseⅠ酶和SacⅠ酶的barcode，美國科羅拉多大學博爾德分校的丹尼爾還發表了設計barcode的軟件。