單鏈退火拼接技術，即所謂的Chew-back組裝，是指創造DNA分子之間的重疊區，通過連接或聚合的思想實現分子間的拼接。這種技術既跳出了限制酶的使用，利用DNA外切酶產生了較長的黏性末端；又應用等級化組裝模式很好地規避了逐級添加的耗時耗力與壹次性組裝可能不正確的拼接，使得無論在組裝的DNA片段數目還是尺度上變得更為高效。例如目前最常用的Gibson
assembly和SLIC技術。
在2008年，Gibson等在構建生殖道支原體基因組時，首先采用自創的體外變溫兩步組裝法獲得了支原體1/4大小基因組，然後對該技術進行改進，將這4個超過100
kb的片段在體外組裝成了完整的583 kb的生殖支原體基因組。2010年，Gibson研究組又通過條件優化將600個帶有20 bp重疊序列的60
bp的寡核苷酸在體外成功人工組裝合成了16.3 kb的小鼠線粒體基因組。
由此可見，Gibson拼接技術可以簡單快速地實現多個DNA片段的壹次性無縫組裝，而且組裝尺度非常可觀，現已成功組裝的最大的DNA分子大小為1.08
Mb。但是隨著壹次組裝的DNA片段的增多，其效率和正確率也會隨之降低，而且需要的重疊序列也較長，引物合成的費用也相應增加。
SLIC是壹種不依賴於序列和連接反應的克隆方法，主要利用T4
DNA聚合酶在無dNTPs存在的情況下發揮3′→5′核酸外切酶活性，將DNA片段消化產生含有末端重疊序列的5′黏性末端，然後DNA片段之間或DNA片段與載體之間依靠重疊序列退火(Rec
A可提高重組效率)，形成環狀中間體，最後直接轉化大腸桿菌感受態細胞，利用大腸桿菌本身的修復系統修復成完整的環狀重組質粒
。2009年，美國哈佛醫學院的StephenElledge研究組利用SLIC實現了9個含40 bp末端重疊序列的DNA片段(275-980
bp)的壹步拼接。
SLIC拼接法不需要連接酶，也不需要考慮插入的DNA片段本身的序列，可以實現多個DNA片段的壹次性組裝，是構建生物合成途徑的壹個有效技術。目前，國外許多公司已經將其商業化，例如Novagen公司的RadianceTM系統和Invitrogen公司的GatewayTM系統都是基於此技術開發出來的。相對於上述Gibson
assembly技術而言，SLIC只需要壹種酶(T4 DNA聚合酶)即可完成多片段組裝，而Gibson
assembly則需要T5核酸外切酶、DNA聚合酶及Taq連接酶的協同作用。但是該技術只能組裝中等尺度的DNA片段，而Gibson
assembly則可以組裝高達580 kb的DNA大片段。
此外，In-FusionTM Cloning也是壹種與SLIC類似的不依賴於連接反應的組裝技術，不同的是In-FusionTM
Cloning使用的是壹種功能類似的牛痘DNA聚合酶而非T4 DNA聚合酶，而且它只需要15 bp的重疊序列，而SLIC則需要至少40 bp的重疊序列。目前Gibson有商業化的試劑盒。
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/html/wswxtbcn/2015/11/tb15112229.htm