慶應三年11月18日（1867年12月13日）夜，被新撰組派出的人暗殺在七條油小路，史稱油小路事件。
伊東的遺體被放在原地作為吸引禦陵衛士的誘餌，後來果然發生了禦陵衛士和埋伏好的新撰組在油小路的亂鬥，衛士中有三人戰死。四具屍體在數日間壹直被丟棄在油小路。
那以後，他被埋葬在壬生光緣寺。新撰組離開京都之後，活下來的衛士把死去的同伴改葬到東山戒光寺。
順便壹提，也有壹種流行不廣的看法認為，伊東是被齋藤暗殺的，來源於齋藤長子的敘述——但是，“同誌的暗殺”指的是油小路事件還是之後在油小路的亂鬥就不得而知了。此外，齋藤是近藤安插在禦陵衛士中的間諜這樣的說法流傳雖廣，真相卻完全不明，似乎有人認為齋藤在晚年還曾流露出“對不起伊東先生”這樣的意思來。