哈哈哈，因為之前壹直在臨床和實驗室像小陀螺壹樣，感覺自己什麽都是壹團糟，什麽都不懂。現在開始重新做人，看到什麽都去仔細了解壹下，就從組會上老聽但是並不懂的cre呀，loxp呀，reporter鼠呀的，感覺好難，去了解了壹下，都是些什麽鬼。
之前壹點都不了解這個東西，沒有接觸過基因重組小鼠實驗。就去看了下相關文章，裏面有涉及到這個基因重組技術，跟朋友那才了解，獲悉Cre-Lox 在動物試驗裏是很常用的技術。整理的內容就是目前自己理解的，哪裏不對請糾正，含淚萬分感謝。也希望給不了解它的人提供壹些有幫助的信息。
Cre最早是微生物裏發現的基因，它可以編碼Cre recombinase，Cre重組酶可以識別特異性序列，這個序列被稱作Loxp序列，有34bp長。Cre重組酶會識別到Loxp序列並且修改Loxp之前的基因/序列(取決於Loxp的方向，建議維基百科看詳細介紹，此處重點)，經常用這個技術knockout gene。
壹般這個基因重組技術會用到雜交。打個比方，父親老鼠裏的某特異性基因A(我們感興趣的基因，比如細胞態/組織特異表達的基因)裏，在胚胎時期被修改並插入Cre基因序列，這樣以來它所有細胞的基因組裏這個特異基因中都帶有了Cre基因序列，Cre基因的表達和翻譯受到該特異性基因A的啟動子影響，也就是說如果壹個細胞裏A基因被激活/可以轉錄的，那麽Cre基因也同樣被激活/可以轉錄的。
但是，還沒完，Cre轉錄之後目的是編碼蛋白啊，壹種叫做 Cre重組酶 的東西，還需要 FLox 啊。通常Loxp會在母親鼠裏面，目的是切掉兩個Loxp中間的序列或者基因，起到壹定的生物學作用。用到的也是我看的這篇文章提到的，胚胎細胞開始在母親鼠的Rosa26區域/基因的兩個外顯子之間轉入Loxp序列(據說都這麽幹)，Loxp中間是壹個STOP基因，這段序列可以阻止下遊的基因被轉錄，類似轉錄停止位點，還沒完，還是在Rosa26基因的兩個外顯子之間緊隨Loxp-stop-Loxp之後，還有壹些 reporter gene 被加入裏，報告基因壹般包括LacZ，GFP，YFP，etc(如果不了解這些報告基因，建議維基百科看詳細介紹，此處重點)。所以說在通常情況下母親鼠裏全體細胞裏Rosa26基因都是轉錄到STOP序列後停止了。還有壹點要提的就是,Rosa26這個基因在老鼠裏幾乎是所有細胞/組織都會轉錄的(啟動子是工作的)但是這個基因沒什麽大用，所以大家在這裏面各種修改添加都不會影響到小鼠的健康問題。那麽，現在有了A基因-Cre父親鼠和Rosa26-Loxp-reporter母親鼠，接下來就是讓他們別閑著造小鼠。他們的孩子就壹般標記成A-Cre::RLacZ/A-Cre::RGFP/A-Cre::RYFP/ etc，“::”代表的意思是？沒錯“雜交”，所以這個雜交小鼠壹般是研究的目的樣品。 因為在這壹代出生的小鼠身上同時包含了兩處基因被修飾的地方，壹個是A基因，壹個是Rosa26區域/基因。目的基因A壹般應該是特異性的，只在某些細胞或者某些組織特異表達的(壹些marker基因)，那麽在這些A基因表達的細胞/組織裏Cre也跟著表達了，因為Cre嚴格受到A基因的啟動子調控，隨後Cre的mRNA編碼成Cre重組酶出去工作了(細胞主要的功能體現者是蛋白質)。隨著Cre重組酶的表達接下來會切斷Rosa26兩個外顯子內，兩個Loxp序列之間的STOP基因，所以呢，沒錯後面的Repoter gene開始轉錄了，大便通暢的趕腳。所以我們可以通過檢測Repoter基因產物可以間接的檢測到這些細胞，比如組織染色，in situ hybridization(ISH)染色，熒光檢測，etc。
這時候可能會問到，那直接在特異基因後添加個repoter gene不就可以輕松搞定了嗎？何必這麽麻煩，弄來弄去還需要嘿咻嘿咻。重點在這裏，不論是加在A基因後的Cre也好，或是直接加個repoter gene也好，他們都會直接/即時的受到A基因的活性調節，非常同步；基因重組小鼠的情況則不然，Cre重組酶表達後會不可逆轉的切掉該細胞的STOP基因，repoter gene會持續表達下去，也就是即使後來Cre基因不轉錄了，妳依然會看到repoter gene在該細胞表達，頓時感覺想出這個技術的人太牛了，所以這個基因重組技術通常可以被用於追蹤勘測壹些細胞態轉化分化，“即使妳變了我也認得妳”。
Cre/LoxP系統來源於F1噬菌體，是非常經典有效的基因編輯技術。
Cre重組酶(cyclizationrecombination)，它是壹種由343個氨基酸組成的單體蛋白，可以引發loxP位點的DNA 重組。
Cre就是壹個重組酶，可以識別LoxP位點。
Inducible Cre: These constructs require the addition of an exogenous ligand (e.g. tamoxifen) to activate Cre. One advantage of this system is tight temporal regulation.
（1）誘導Cre：這些結構需要添加外源性配體(如他莫昔芬)來激活Cre。這個系統的壹個優點是嚴格的時間管理--這壹個是我們最常用到的！
Promoter-regulated Cre: The promoter region defines the areas in which Cre will be expressed. Cre may be expressed globally under a broadly active promoter like CAG, or expressed only in a subset of cells under a more specific promoter (e.g. Rho-Cre is expressed in the retina).
（2）啟動子調控的Cre：啟動子區域定義了Cre表達的區域。Cre可能在廣泛活躍的啟動子(如CAG)下全局表達，也可能僅在特定啟動子下的細胞子集中表達(如Rho-Cre在視網膜中表達)。
Fluorescent Cre: The fusion of Cre to a fluorescent reporter enables visualization of Cre expression.
（3）Cre與熒光報告基因的融合使Cre表達可以可視化--可以直接看見熒光哦！
Optimized Cre: Codon-optimized Cre (iCre) is expressed at higher levels in mice than P1 bacteriophage Cre, facilitating high rates of Cre-driven recombination. CREM (or Cre-M) has been engineered to contain an intron, preventing Cre expression when cloning in E. coli. This alteration enables the generation of a single vector containing Cre and a floxed construct (unmodified Cre will cause recombination in E. coli, deleting the floxed portion of a construct during the cloning process). VCre and SCre are alternative Cre recombinases that recognize specific mutant loxP sites, VloxP and SloxP sites respectively.
（4）嗯......好復雜
Split Cre: Cre recombinase is split in half into N and C terminal Cre fragments (NCre and CCre, respectively) and placed under the control of different promoters. Expression of both N and CCre in the same cell type allows for recombination of LoxP flanked DNA sequences.
（5）將Cre重組酶分為N和C端Cre片段(分別為NCre和CCre)，置於不同啟動子的控制下。N和CCre在同壹細胞類型中的表達允許LoxP側邊DNA序列的重組。
loxP是壹段長34bp的DNA序列，是重組酶識別的位點，被稱為loxP位點(10cus of X—over in P1)。
參考資料：
/blog/introduction-to-cre-lox
https://www.addgene.org/cre-lox/
這些LoxP結構允許crec調控基因表達，Cre可激活或抑制基因表達，這取決於其結構。常見構造類型包括：
（1）依賴於Cre的基因表達：在感興趣的基因上遊，在任何壹側（通常稱為“lox-stop-lox”或“LSL”盒）放置壹個帶有loxP位點的停止密碼子，可以防止Cre缺失時的基因表達。在Cre存在的情況下，停止密碼子被切除，基因表達繼續進行。
為啥要突然提到AAVS1？是因為以上提到的LoxP我們已經知道，應該把LoxP放在目的基因的內含子中（中間是外顯子，最好是功能區外顯子）。而Cre想要穩定表達怎麽辦呢？這時候就要借助AAVS1位點的作用了。 已有試劑盒可以做到 AAVS1 位點（又稱為 PPP1R2C 位點）位於人類基因組第19號染色體，是壹個經過驗證、能確保轉入 DNA 片段預期功能的“安全港”位點。該位點是壹個開放的染色體結構，能保證轉入基因能被正常轉錄。另外很重要的壹點是在該位點插入外源目的片段對細胞無已知的副作用。