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M13噬菌體DNA提取方法?

M13和其它的絲狀噬菌體載體,在文庫構建和為序列測序提供單鏈DNA和引人突變方面十分有用.將適量M13絲狀噬菌體或者相關噬粒(M13來源)感染的液體培養物離心,上清中的單鏈噬菌體DNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附於離心柱內矽基質膜,再通過壹系列快速的漂洗-離心的步驟,將鹽、細胞代謝物,蛋白等雜質去除,最後低鹽的洗脫緩沖液將純凈噬菌體單鏈DNA從矽基質膜上洗脫.

博淩科為 M13噬菌體單鏈基因組DNA快速提取試劑盒 目錄號 1421

操作步驟:(實驗前請先閱讀註意事項)

以800μl噬菌體感染細菌培養上清提取舉例:

提示:第壹次使用前請先在漂洗液WB中加入指定量無水乙醇,充分混勻,加入後請及時在方框打鉤標記已加入乙醇,以免多次加入!

1.將M13絲狀噬菌體或者相關噬粒(M13來源)感染的液體培養物分裝在1.5毫升離心管,12,000rpm離心5分鐘沈澱菌體.

2.小心取800μl上清轉入新的1.5ml離心管,加入400μl結合液MB,充分混勻.

如果使用的上清大於或者小於800μl,則結合液MB的用量需要按照比例增加或者減少.

3.將上述混合物加入壹個吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm離心15秒,倒掉收集管中的廢液.

吸附柱壹次最多只可以容納大約700μl混合物,因此需要分次把混合物加到吸附柱內,重復步驟3.

4.加入700μl漂洗液WB(請先檢查是否已加入無水乙醇!),12,000rpm 離心30秒,棄廢液.

5.將吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm離心2分鐘,盡量除去漂洗液,以免漂洗液中殘留乙醇抑制下遊反應.

6.取出吸附柱AC,放入壹個幹凈的離心管中,在吸附膜的中間部位加60μl洗脫緩沖液EB(洗脫緩沖液事先在 50℃水浴中預熱),室溫放置1分鐘,12,000rpm 離心1分鐘.如果想得到較多量的DNA,可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中,10,000rpm離心1分鐘.

洗脫體積越大,洗脫效率越高,如果需要DNA濃度較高,可以適當減少洗脫體積,但是最小體積不應少於40μl,體積過小降低DNA洗脫效率,減少DNA產量.

7.DNA可以存放在2-8℃,如果要長時間存放,可以放置在-20℃.

v 附錄(M13噬菌體感染細菌培養上清準備過程):

下面舉例說明M13噬菌體感染細菌培養上清準備過程,詳細的M13噬菌體(或M13來源噬粒)培養和上清準備過程請參見『分子克隆』第二版.

1.37℃ 振搖過夜培養合適的噬菌體宿主菌(如JM109).

2.使用6%的過夜培養菌接種新鮮的LB培養液,37℃振搖培養壹個小時.

3.根據M13噬菌體的儲存液的濃度(滴度)按照0.5-1.5%(V/V)的比例加入噬菌體來感染宿主菌.37℃振搖培養5-6個小時.

4.將上面M13絲狀噬菌體或者相關噬粒(M13來源)感染的液體培養物分裝在1.5毫升離心管,12,000rpm離心5分鐘沈澱菌體.

5.可選步驟:小心取1毫升上清轉入新的1.5ml離心管,重復步驟4離心5分鐘.

這步有助於去除上清中殘留的微量宿主菌RNA或者DNA.

6.小心取800μl上清轉入新的1.5ml離心管.

7.現在可以按照博淩科為說明書的操作步驟提取噬菌體單鏈DNA了.