2.慢病毒Cas9-Blast與pCMV-dR8.91和pCMV-VSV-G質粒***轉染到HEK293T細胞中，然後收割病毒滴定後儲存。該步的目的是對慢病毒Cas9-Blast進行包裝，得到能夠將目的序列穩定插入到宿主細胞中的病毒顆粒該病毒顆粒用於感染宿主細胞B16F10。
3.將慢病毒Cas9-Blast感染B16F10後使用殺稻瘟菌素進行篩選，得到穩定的帶有Cas9的細胞，即B16F10-Cas9
4.目的：為了獲得高Cas9活性的克隆
B16F10-Cas細胞以單細胞分選入96孔板並用慢病毒感染，驅動Cd274和熒光探針特異性的gRNA的表達。感染10天後，將每個單獨的克隆用γIFN刺激，並使用抗-CD274抗體通過FACS測定PD-L1的表達。通過測量轉導的（mCherry）群體中PD-L1陰性細胞的百分比來評估Cas9編輯效率。
5.（1）對T細胞介導的細胞毒性具有抗性的陽性對照：B16F10-Cas B2m缺陷（B2m缺失導致MHCⅠ類分子折疊異常從而對免疫檢查點抑制劑耐藥）
（2）對T細胞介導的細胞毒性敏感的陽性對照：B16F10-Cas-cd274缺失（cd274編碼PD-L1，它的缺失導致免疫檢查點破壞，無法產生免疫耐受，導致細胞對T細胞介導的細胞毒性敏感）
6.將（1）和（2）分別與親本B16F10-Cas細胞***培養，得到的產物與與體外活化的OT-I或Pmel-1CD8 T細胞***培養。為了用OT-I T細胞進行篩選，在與T細胞***培養之前，用Ova（SIINFEKL）肽在37℃下脈沖B16F10細胞2小時。為了被Pmel-1T細胞最佳殺傷，在與T細胞***培養之前，用IFNγ預處理B16F10細胞24小時以增強表面MHCI類表達（在不存在IFNγ時非常低）。篩選1-3天後，將腫瘤細胞從平板上分離，並且在對DAPI-CD45-CD3-群體進行門控後通過FACS測定B2m-/-（GFP+）和Cd274-/-（mCherry+）細胞的百分比。通過比較選擇前和之後陽性對照細胞與親代細胞的比例來計算倍數富集和消耗。
6得到的結果圖為：縱坐標表示Cd274-/-缺陷型細胞的mCherry+熒光強度，橫坐標表示B2m-/-缺陷型細胞的GFP熒光強度。從A中可以看到在T細胞篩選之前和之後Cd274-/-缺陷型細胞的熒光強度減弱，而B2m-/-缺陷型細胞的熒光強調度沒有明顯變化，這說明了在T細胞處理Cd274-/-缺陷型細胞和B2m-/-缺陷型細胞之後，Cd274-/-缺陷型細胞大部分被T細胞殺死，而B2m-/-缺陷型細胞對T細胞殺傷具有抗性。
7.CRISPR Brie慢病毒和質粒psPAX2和pCMV-VSV-G***轉染到HEK293T細胞中並收割病毒儲存於-80℃。 目的是 對CRISPR Brie慢病毒進行包裝，得到將目的序列穩定插入到宿主細胞中的病毒顆粒該病毒顆粒用於感染宿主細胞B16F10-Cas細胞中。
8.將7中收割的病毒感染靶細胞B16F10-Cas，並用嘌呤黴素篩選被CRISPR Brie慢病毒穩定感染的細胞系，測定滴度後計算sRNA的感染率。
9.Pmel-1篩選：B16F10-Cas9（克隆4）細胞用MOI為0.06的“Brie”慢病毒感染，在Pmel-1篩選之前，B16F10細胞鋪板，①用於基因組分離提取，②對照組：與OT-1T細胞***培養（未使用OVA脈沖），③實驗組：與Pmel-1***培養。與T細胞***培養之後移去T細胞後再生的細胞表示對T細胞具有抗性的細胞，將再生的細胞掛下，使用gRNA試劑盒PCR擴增，然後對gRNA 的表現度進行Illumina測序。
10.OT-I篩選：B16F10鋪板：①用於基因組分離提取，②對照組：與OT-1T細胞***培養（未使用SIINFEKL脈沖），③實驗組：與OT-IT細胞***培養（使用SIINFEKL脈沖）。與T細胞***培養之後移去T細胞後再生的細胞表示對T細胞具有抗性的細胞，將再生的細胞掛下，使用gRNA試劑盒PCR擴增，然後對gRNA 的表現度進行Illumina測序。