單鏈 DNA 的酶切和連接是比較困難的，因此 M13 噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈 RF DNA。RF DNA 很容易從感染細胞中純化出來，可以象質粒壹樣進行操作，並可通過轉化方法再次導入細胞。
（1）載體的插入位點
在 M13 噬菌體基因組中絕大多數為必需基因，只有兩個間隔區可用來插入外源 DNA（基因 Ⅱ/Ⅳ 和基因 Ⅷ/Ⅲ 之間）。基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間的 508bp 間隔區是主要的外源片段插入位點。在基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 之間的小間隔區也可用來插入外源片段，但是在操作過程中，需要獲得感染細胞的菌落進行影印篩選，比利用可見的噬菌斑方法更慢更麻煩。基因 Ⅹ 也可用來克隆外源片段。
（2）M13 噬菌體載體組成
現在所使用的 M13 噬菌體載體是 Messing 及其同事建立的 mp 系列載體，以基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間的區域作為外源 DNA 插入區。
mp 載體系列都是從同壹個重組 M13 噬菌體 （M13mpl） 改造而來的。在 M13mpl 載體中，間隔區內的 HaeⅢ 位點插入了壹小段大腸桿菌 DNA ，引入 α 互補篩選。
（3）M13載體系列
① M13載體系列的命名：M13mpn，n代表系列數字。
② 對M13mp1的改進：加上常用的酶切位點。如B. Gronenborn和J. Messing1978年把LacZ’ 5’端的第13個核苷酸G突變成A，產生了壹個EcoR I切點，構建成M13mp2。
③ 對M13mp2的進壹步改進產生了M13mp系列載體。在M13mp2的LacZ’的5‘端加上壹段人工合成的多克隆位點（MCS）。如M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19分別對應於pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。
（4）M13mpl8 和 M13mpl9
M13mpl8 和 M13mpl9 這兩個載體含有 13 個不同的酶切位點，可供插入由多種各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段。 M13mpl8 和 M13mpl9 DNA 的全序列已經測定完成，這兩種載體只是在 lacZ 區內不對稱的多克隆區的方向上有所不同。
當 RF DNA 被兩種不同的限制酶切割以後， M13mpl8 和 M13mpl9 輕易不能重新環化。僅當連接混合液中含有帶匹配末端的外源雙鏈 DNA片段時，方可閉合成環。這壹片段在 M13mpl8 和 M13mpl9 中將以兩個互為相反的方向插入。這樣壹來，在 M13mpl8 的正鏈中含有外源 DNA 雙鏈的其中壹條鏈，而在 M13mpl9 正鏈中則含有外源 DNA 的另壹條鏈，即 M13mpl8 重組體的子代噬菌體內含有外源 DNA 的壹條鏈， M13mpl9 重組體的子代噬菌體內則含有它的互補鏈。故用 M13mpl8 和 M13mpl9 作為壹對載體，就可能用壹個引物 （通用引物），從所插入 DNA 片段的任壹端開始，測定互為相反的兩條鏈的 DNA 序列，並可制備只與外源 DNA 的任意壹條鏈互補的 DNA 探針。