第二代測序（Next-generation sequencing，NGS）又稱為高通量測序（High-throughput sequencing），是基於PCR和基因芯片發展而來的DNA測序技術。我們都知道壹代測序為合成終止測序，而二代測序開創性的引入了可逆終止末端，從而實現邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis）。二代測序在DNA復制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標記（壹般為熒光分子標記）來確定DNA的序列，現有的技術平臺主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由於在二代測序中，單個DNA分子必須擴增成由相同DNA組成的基因簇，然後進行同步復制，來增強熒光信號強度從而讀出DNA序列；而隨著讀長增長，基因簇復制的協同性降低，導致堿基測序質量下降，這嚴格限制了二代測序的讀長（不超過500bp），因此，二代測序具有通量高、讀長短的特點。二代測序適合擴增子測序（例如16S、18S、ITS的可變區），而基因組、宏基因組DNA則需要使用鳥槍法（Shotgun method）打斷成小片段，測序完畢後再使用生物信息學方法進行拼接。
流程：
①末端修飾：
使用Taq聚合酶補齊不平的末端；
並在兩個末端添加突出的堿基A，從而產生粘性末端（若使用Taq酶擴增，則無需末端修飾）；
產生粘性末端的片段可以添加接頭（Adaptor）。
②添加接頭：
經過末端修飾後的PCR片段末端具有突出的A尾，而接頭具有突出的T尾，可以使用連接酶將接頭添加到DNA片段兩端。
NEB的接頭為特殊的堿基U連接的環狀結構（可以增強穩定性），因此連接接頭後，還需要將堿基U刪除從而形成“Y”形接頭。
上壹步添加的接頭主要是為了後續PCR中作為引物擴增繼續添加文庫index和與測序平臺互補的寡核苷酸序列（此外還作為測序引物Rd1 SP/Rd2 SP）。
之所以為“Y”型開叉結構，是因為每壹端接頭是兩條不互補的序列（每壹端都是Rd1 SP與Rd2 SP交錯），連接酶沒有選擇性，每個接頭都是只靠突出的T來與DNA連接，“Y”接頭保證了每條單序列兩端均為不同的測序引物，從而在後續PCR中可以連接不同的寡核苷酸序列（P5/P7）。