第二代測序為高通量測序，采用微珠或高密度芯片邊合成邊測序，代表有454，solexa，solid，高通量，可壹次獲得數G數據，相對與第三代，都仍然需要擴增的方法放大信號，擴增後再檢測。
第二代測序技術的核心思想是邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis），即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列，現有的技術平臺主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。
第壹代測序技術的主要特點是測序讀長可達1000bp，準確性高達99.999%，但其測序成本高，通量低等方面的缺點，嚴重影響了其真正大規模的應用。因而第壹代測序技術並不是最理想的測序方法。
經過不斷的技術開發和改進，以Roche公司的454技術、illumina公司的Solexa，Hiseq技術和ABI公司的Solid技術為標記的第二代測序技術誕生了。
第二代測序技術大大降低了測序成本的同時，還大幅提高了測序速度，並且保持了高準確性，以前完成壹個人類基因組的測序需要3年時間，而使用二代測序技術則僅僅需要1周，但在序列讀長方面比起第壹代測序技術則要短很多。
：1）測序文庫的構建（Library Construction）
首先準備基因組（雖然測序公司要求樣品量要達到200ng，但是Gnome Analyzer系統所需的樣品量可低至100ng,能應用在很多樣品有限的實驗中），然後將DNA隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段，並在兩頭加上特定的接頭（Adaptor）。如果是轉錄組測序，則文庫的構建要相對麻煩些，RNA片段化之後需反轉成cDNA，然後加上接頭，或者先將RNA反轉成cDNA，然後再片段化並加上接頭。片段的大小（Insert size）對於後面的數據分析有影響，可根據需要來選擇。對於基因組測序來說，通常會選擇幾種不同的insert size，以便在組裝（Assembly）的時候獲得更多的信息。
2）錨定橋接（Surface Attachment and Bridge Amplification）
Solexa測序的反應在叫做flow cell的玻璃管中進行，flow cell又被細分成8個Lane，每個Lane的內表面有無數的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈後與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構，以供後續的預擴增使用。
3）預擴增（Denaturation and Complete Amplification）
添加未標記的dNTP 和普通Taq 酶進行固相橋式PCR 擴增，單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性，釋放出互補的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過不斷循環，將會在Flow cell 的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。
4）單堿基延伸測序（Single Base Extension and Sequencing）
在測序的flow cell中加入四種熒光標記的dNTP 、DNA聚合酶以及接頭引物進行擴增，在每壹個測序簇延伸互補鏈時，每加入壹個被熒光標記的dNTP就能釋放出相對應的熒光，測序儀通過捕獲熒光信號，並通過計算機軟件將光信號轉化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。從熒光信號獲取待測片段的序列信息的過程叫做Base Calling，Illumina公司Base Calling所用的軟件是Illumina’s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。讀長會受到多個引起信號衰減的因素所影響，如熒光標記的不完全切割。隨著讀長的增加，錯誤率也會隨之上升。
5）數據分析（Data Analyzing）
這壹步嚴格來講不能算作測序操作流程的壹部分，但是只有通過這壹步前面的工作才顯得有意義。測序得到的原始數據是長度只有幾十個堿基的序列，要通過生物信息學工具將這些短的序列組裝成長的Contigs甚至是整個基因組的框架，或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上，並進壹步分析得到有生物學意義的結果。
參考資料：