PCR儀器的使用方法

1目的 保證GeneAmp 7000型熒光定量PCR儀的正常使用。 2 該SOP變動程序 本文件的變動，可由任壹使用該文件的工作人員提出，報經室技術負責人，由季度組長會議決定。如通過則公布實行。 3 適用範圍 GeneAmp 7000型熒光定量PCR儀。 4 使用方法 ⑴依次打開電腦顯示器和電腦主機電源開關，進入Windows 2000界面。 ⑵接著打開PCR儀電源開關，預熱5分鐘。 ⑶按需要在電腦上設定壹個新的運行版面和程序。 ⑷推開滑門，將樣品放入樣品槽內，關上儀器滑門。 ⑸運行程序，在反應結束後按Save鍵儲存實驗結果。 ⑹關閉PCR儀電源開關。 ⑺分析實驗結果；發放臨床報告。 5 註意事項 ⑴儀器應放置在水平堅固的平臺上，外界電源系統電壓要匹配，並要求有良好的接地線。 ⑵環境溫度保持在23℃左右，濕度保持在60％左右。 ⑶儀器應配備功率≥3000W的穩壓器。 ⑷儀器應定期清潔維護。 ⑸儀器使用時應嚴格遵守上述使用步驟。 6 維護方法 6.1微軟Windows 2000操作系統的維護 硬盤驅動器每月29日運行壹次碎片清除程序，使用Norton Utilities或類似軟件。現以Norton為例： ①放入Norton Utilities光盤，運行安裝（Setup）文件。 ②安裝完後取出Norton Utilities光盤，重新啟動計算機 ③運行Norton Utilities軟件，並啟動其清理碎片/優化程序。 ④運行完成後，檢查以確信無嚴重錯誤記錄，退出Norton Utilities。 ⑤以後每次運行Norton Utilities軟件中的清理碎片/優化程序就行了。 6.2 7000 PCR擴增儀的維護 1.樣品槽的清潔樣品槽每月29日進行壹次清潔，如出現樣品槽汙染情況則隨時清潔。操作方法： ①運行25℃HOLD程序使樣品槽溫度達到室溫。關閉儀器，等待10分鐘。 ②從樣品槽移去樣品架。 ③在樣品槽中加入少量95％乙醇，用棉簽擦洗反應孔。 ④用幹棉簽吸幹乙醇。 ⑤向裏推動滑門，鎖住，使樣品槽升溫到50℃，以蒸發掉多余的乙醇。 2.熱蓋的清潔熱蓋每月29日進行壹次清潔，如有需要隨時進行。 ①運行25℃HOLD程序使樣品槽溫度達到室溫。關閉儀器，等待10分鐘。 ②逆時針旋轉GeneAmp 7000光源檢測器頂部旋鈕。向後推GeneAmp 7000光源檢測器至滑軌距離的大約1/3處。 ③GeneAmp 7000光源檢測器滑軌上有缺口。從這些缺口垂直擡起GeneAmp 7000光源檢測器，小心側放於儀器頂蓋上。不要從儀器取走熱蓋。 ④用濕潤的鏡頭紙清潔加熱蓋，待幹。 ⑤將GeneAmp 7000光源檢測器重新安裝回滑軌。 6.3 GeneAmp 7000光路系統的維護 1.調準ROI參照條調準ROI參照條在儀器更換鹵素燈、儀器定期校準或儀器維修後進行。不得由壹般實驗人員進行該項操作。 ①推開滑門，在樣品槽中放入熒光檢測板。 ②GeneAmp 7000儀器滑門向前滑移蓋住樣品槽，並關緊。 ③從Start菜單或桌面點選運行GeneAmp 7000 SDS管理軟件。 ④積分時間從512ms開始，用位置調整點，調節ROI的高度與右邊線。 ⑤逐漸增加積分時間，直到可以看到至少四個塊（約4096ms）。 ⑥調整最左側位置調整點。 ⑦減少積分時間到1024ms，調整上方與底部的位置調整點。 ⑧減少積分時間以便最右側塊可見但未飽和（約512ms），調節最右側位置調整點。如有需要用右上角拖動點調整圖象的傾斜度（以左上角為中心旋轉）。 ⑨調節後的參照條寬度必須在ROI參照塊間有小空隙。 2.校正ROI光路 ROI光路校正每月29日進行壹次，以便確信結果仍然是優化的。 ①推開滑門，在樣品槽中放入熒光檢測板。 ②GeneAmp 7000儀器滑門向前滑移蓋住樣品槽，並關緊。 ③從Start菜單或桌面點選運行GeneAmp 7000 SDS管理軟件。 ④點選Show ROI復選框。每個樣品孔周圍出現壹藍色橢圓圈。 ⑤點選Show Saturation復選框。 ⑥設定積分時間為1024ms；打開鹵素燈和光閘。 ⑦點擊LIVE按鈕獲取圖象，然後在任何地方左擊停止。獲取中等程度未飽和圖象（無紅色圖象）。 ⑧從Edit菜單中選擇Calibrate ROIs每個孔都會選取合適的ROI，確定96孔都被藍色橢圓圈正確界定。 ⑨圖象太亮太暗都會出現錯誤信息，相應增加或減少積分時間，並重復上述第8步直到無錯誤信息出現。 ⑩檢查孔ROI位置，所有孔信息都應包含在96個ROI橢圓圈中。如果沒有，重復8和9步。 3.檢查樣品槽的熒光汙染檢查樣品槽的熒光汙染每月29日進行壹次，如有需要隨時進行。 ①開啟GeneAmp 7000型熒光定量PCR儀電源。 ②從Start菜單或桌面點選運行GeneAmp 7000 SDS管理軟件。 ③從樣品槽中移去反應板。GeneAmp 7000儀器滑門向前滑移蓋住樣品槽，並關緊。 ④單擊New Document建立壹個新的GeneAmp 7000文件 ⑤點擊instrument中的catibrate顯示ROI inspector窗口 ⑥把Exposure Time調到最大，把Capture image From調到最敏感的FiterB點,單擊Snapshot獲取圖象。 ⑦減少積分時間，改變Capture image From中的A，B，C，D單擊Snapshot 觀察96孔中背景熒光。如孔有顯著熒光則表示該孔存在熒光汙染。 ⑧按照樣品槽的清潔程序清洗樣品槽。 4.更換鹵素燈儀器使用大約2000小時後應更換鹵素燈。 ①關閉儀器，冷卻15分鐘。 ②將樣品板放入儀器樣品槽，關閉滑門。在儀器的頂部向上打開燈艙門。 ③擰下固定燈罩的螺絲，將燈罩向前滑移，使其從設備上取下。 ④將舊燈泡向前滑移，使其從夾狀支架上取下，並將燈泡從燈座上拔下。 ⑤把新燈泡尾部的插桿插入燈座上的插孔，使二者連接起來。 ⑥使燈的長軸與儀器前向平行（即豎直於地面），將新燈泡滑回燈位。 ⑦在燈艙門處於打開狀態下，打開儀器，確證在儀器運行時燈也能打開。 ⑧蓋上燈罩，擰緊螺絲，關上燈艙門。 ⑨若新鹵素燈不工作，GeneAmp 7000電源保險絲可能有問題。 7 校準 GeneAmp 7000型熒光定量PCR儀為復雜精密儀器，其校準工作需由專業工程師進行。除與儀器廠家達成協議定期校準以外，以實驗判斷儀器校準狀態也可為何時進行儀器校準提供信息。 ⑴通過對室內質控圖的分析，我們可以及時發現系統誤差的出現。經過分析排除了試劑和人員誤差後，應懷疑是否儀器出現了檢測偏差需要校準。此時進行儀器狀態效驗實驗確定是否需要進行儀器校準。 ⑵儀器狀態效驗試驗 ①使用標準化試劑作為效驗試劑。 ②在儀器處於校準狀態下，由固定人員用標準化試劑對102、103、104、106標準品進行擴增實驗。該實驗在兩個月內應進行20次。分別計算標準曲線的斜率、截距、相關性的控制限。 ③每年6月、12月由固定人員進行上述實驗，觀察標準曲線的三個參數是否處在控制範圍和102標準品是否檢出。 ④當102標準品未檢出、標準曲線的三個參數超出控制範圍或僅出現後者時，先排除實驗的人員、試劑因素，再重復實驗。如結果依然，聯系廠家立即進行儀器校準。 ⑤當僅有102標準品未檢出時，檢查實驗全過程。再次上機檢測102標準品兩枚。仍未檢出聯系廠家進行儀器校準。 ⑥儀器經過校準後，重復該實驗。結果歸入儀器檔案。標本前處理標準操作程序 1 目的 保證標本處理標準化、規範化，使不規範操作因素對實驗結果造成的影響減至最小。 2 該SOP變動程序 本文件的變動，可由任壹使用該文件的工作人員提出，報經室負責人決定。如通過則公布實行。 3 適用待處理標本範圍臨床基因擴增實驗室現行檢測項目。 4 標準操作程序 4.1 DNA血清類（例如HBV） ⑴雙手戴上手套，從冰箱取出標本，將驗單和試管依次編號，收起驗單，棄去手套。 ⑵雙手換上新手套，用鑷子(夾取滅菌物品專用)取出1.5ml離心管，對應標本編號，置於離心管架上。 ⑶將移液器調到50?0?8l，先吸取50?0?8lDNA提取液加入到編好號的離心管中。然後吸取50?0?8l血清，加入離心管中混勻，註意每吸取壹份血清標本應更換壹次槍頭。處理全部標本，然後將離心管插到水浴板上，用鑷子放入水浴鍋，沸水浴10分鐘。 ⑷水浴完成後用鑷子將水浴板取出，轉至4℃靜置8～12小時，然後10000轉 5分鐘離心，取上清液2?0?8l點樣上機。 ⑸收拾臺面至準備狀態。 4.2 RNA血清類（例如HCV） ⑴雙手戴上手套，從冰箱取出標本，將驗單和試管依次編號，收起驗單，棄去手套。 ⑵雙手換上新手套，用鑷子(夾取滅菌物品專用)取出0.5ml滅菌離心管，對應標本編號，置於離心管架上。 ⑶先用5～40?0?8l的移液器，吸取10?0?8lRNA提取液A加入到編好號的離心管中，再用40～200?0?8l的移液器吸取50?0?8l 血清加入，最後用200～1000 ?0?8l移液器加入200 ?0?8lRNA提取液B，在震蕩器上震蕩混勻，冰上放置5分鐘，然後6000轉1分鐘離心。 ⑷去上清，留沈澱。加入450?0?8l 用DEPC水配制的75%的預冷乙醇洗滌沈澱，然後6000轉1分鐘離心，去上清。相同方法再洗壹次，吸幹上清，65℃10分鐘烘幹。 ⑸給烘幹的沈澱中加入18 ?0?8l的反應液I，混勻，再加入2 ?0?8l逆轉錄酶，充分混勻，瞬時離心（3秒），放入溫箱，37℃45分鐘逆轉錄。 ⑹逆轉錄後95℃3分鐘高溫滅活，瞬時離心（3秒），取5 ?0?8l上清立即點樣上機。 ⑺收拾臺面至準備狀態。 4.3 分泌物類（例如CT） ⑴雙手帶上手套，從冰箱取出標本，將驗單和試管依次對應編號，收起驗單，棄去手套。 ⑵雙手換上新手套，用鑷子（夾取滅菌物品專用）取出1.5ml離心管，對應標本編號後，置於離心管架上。 ⑶用鑷子擰下全部試管蓋並依次置於實驗臺面上，試管對應放置於試管架上。 ⑷向每只試管中緩慢加入1ml無菌生理鹽水。 ⑸用左手取試管於旋渦振蕩器上充分振蕩。 ⑹將試管中的洗脫液全部轉至相應離心管。 ⑺將試管和離心管分別放回試管架和離心管盒中前壹排對應位置，並用鑷子將管蓋對號蓋回，把試管架放回冰箱。 ⑻雙手換上新手套，用左手將離心管全部配平，按順序置於離心機中相應位置，以 12000轉離心5分鐘。去上清，沈澱再加1ml生理鹽水打勻，15000 rpm離心5分鐘。（如超過12管，則需分批進行）。 ⑼離心完畢後，左手取出離心管，傾倒上液，再瞬時離心，右手取移液器將管內殘液吸盡，只留下沈澱。如無明顯肉眼可見沈澱，則可在管內留下約50?0?8l液體。 ⑽依次向管中各加入50?0?8lDNA提取液，此時移液器應與管壁約成30度角，吸頭抵至沈澱上方靠管壁處，來回抽吸，將沈澱與DNA提取液混勻。 ⑾將加入DNA提取液的標本沸水浴10分鐘。 ⑿將沸水浴後的標本放置至室溫，並將其放入4℃冰箱中6～8小時保證充分裂解。 ⒀離心標本10000 轉5分鐘。 ⒁換上新手套，取上清液2?0?8l點樣上機。 ⒂收拾臺面至準備狀態。 4.4痰液類（例如TB） ⑴取晨痰加入4倍體積4％氫氧化鈉待其充分液化(30分鐘)，液化過程中，振蕩2～3次，如痰液粘稠，可延長液化時間。 ⑵取1 ml消化液加入離心管，10000轉離心5分鐘 ⑶棄上清留沈澱，加入1ml生理鹽水洗滌，10000 轉 5分鐘離心。 ⑷重復⑶操作，留沈澱，加入50?0?8lDNA提取液，混勻。 ⑸沸水浴10分鐘，4℃放置8～12小時。 ⑹10000 轉5分鐘離心，取上清2?0?8l點樣上機。