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DNA抽提方法與步驟

高中:

原理:

1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2.用冷酒精提取出含雜質較少的DNA。

3.DNA在沸水浴時被二苯胺染成藍色。

方法步驟:

1.提取細胞核物質:順時針方向攪拌,稍快,稍重。 5 min

2.溶解DNA:

3.析出含DNA的黏稠物:蒸餾水300mL,逆時針方向攪拌,緩慢

4.過濾:取黏稠物

5.再溶解:順時針方向攪拌,較慢。3 min

6.過濾:取濾液。

7.提取出含雜質較少的DNA,逆時針方向攪拌,稍慢。5 min

8.DNA的鑒定:沸水浴5min

大學

DNA提取分為三個基本步驟,每個步驟的具體方法可根據樣品種類、影響提取的物質以及後續步驟的不同而有區別。

利用研磨或者超聲破碎細胞,並通過加入去汙劑以除掉膜脂。

加入蛋白酶,醋酸鹽沈澱,或者酚/氯仿抽提,以除掉細胞內的蛋白,如與DNA結合的組蛋白。

將DNA在冷乙醇或異丙醇中沈澱,因為DNA在醇中不可溶而黏在壹起,這壹步也能除掉鹽分。

另外,目前也有利用吸附過柱的方法提取DNA的商業化試劑盒。

2.細胞的破碎

細菌有堅硬的細胞壁,首先要破碎經胞。方法有三種;①機械方法:超聲波處理法、研磨法、勻漿法;②化學試劑法:用SDS處理細胞;③酶解法:加入溶菌酶或蝸牛酶,都可使細胞壁破碎。

3.DNA提取的幾種方法

(1).濃鹽法

A. 利用RNA和DNA在電解溶液中溶解度不同,將二者分離,常用的方法是用1M 氯 納提取化鈉抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的 氯仿壹起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質,此時蛋白質凝膠停留在水相及氯仿相中間,而DNA位於上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA 鈉鹽沈澱出來.

B. 也可用0.15 MNaCL液反復洗滌細胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白.

兩種方法比較,後種方法使核酸降解可能少壹些.

C.以稀鹽酸溶液提取DNA 時,加入適量去汙劑,如SDS可有助於蛋白質與DNA 的分離。在提取過程中為抑制組織中的DNase對DNA 的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,並稱SSC溶液,提取DNA. (2).陰離子去汙劑法; 用SDS或二甲苯酸鈉等去汙劑使蛋白質變性,可以直接從生物材料中提取DNA .由於細胞中DNA與蛋白質之間常借靜電引力或配位鍵結合,因為陰離子去汙劑能夠破壞這種價鍵,所以常用陰離子去汙劑提取DNA

(3).苯酚抽提法:苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時,由於蛋白與DNA 聯結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶於酚相,而DNA溶於水相。離心分層後取出水層,多次重復操作,再合並含DNA 的水相,利用核酸不溶於醇的性質,用乙醇沈澱DNA 。此時DNA是十分粘稠的物質,可用玻璃漫漫繞成壹團,取出。此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態

(4).水抽提法:利用核酸溶解於水的性質,將組織細胞破碎後,用低鹽溶液除去RNA,然後將沈澱溶於水中,使DNA充分溶解於水中,離心後收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調節至2.6M.加入2倍體積95%乙醇,立即用攪拌法攪出.然後分別用66% ,80%和95%乙醇以及丙銅洗滌,最後在空氣中幹燥,既得DNA樣品.此法提取的DNA中蛋白質含量較高,故壹般不用.為除蛋白可將此法加以改良,在提取過程中加入SDS.