RNAi發揮作用的過程可分為兩個階段，即起始階段和效應階段。在起始階段，雙鏈RNA分子進入細胞後被稱為Dicer的核酸酶切割為2123個核苷酸長的小分子幹擾RNA片段（small：interfering：RNA，siRNA）。Dicer核酸酶屬於RNaseⅢ家族，能夠特異識別雙鏈RNA，產生的小片段RNA的3′端都有2個突出堿基。然後雙鏈siRNA與核酶復合物結合形成RNA誘導沈默復合體（RNA-induced：silencing：complex，RISC），隨後進入RNA幹擾效應階段，即siRNAs打開雙鏈從而激活RISC，激活的RISC通過堿基配對與具同源序列的mRNA識別並結合，並在距離siRNA：3′端12個堿基的位置切割mRNA。同時，siRNA可作為引物並以mRNA為模板合成新的dsRNA。這樣又可進入上述循環，繼續對目的mRNA進行切割，從而使目的基因沈默，產生RNAi現象。確切切割機制尚不明了，但每個RISC都包含壹個siRNA和壹個不同於Dicer的核酸酶。