DNA甲基化是表觀遺傳學的中最為常見的壹種修飾，其主要形式包括：5-甲基胞嘧啶 (5-mC)、少量的N6-甲基腺嘌呤 (N6-mA) 以及7-甲基鳥嘌呤(7-mG)。
目前常說的DNA甲基化壹般指 CpG島甲基化 ，即在 DNA甲基化轉移酶（DNMTs） 的作用下使CpG二核苷酸5’端的 胞嘧啶 轉變為 5’甲基胞嘧啶 。
哺乳動物體細胞的DNA胞嘧啶甲基化主要發生在 CpG島
CpG島（CpG islands） :指CpG序列密度相比整個基因組來說是特別高的富集區域，壹般位於 啟動子附近 ， 5’端非翻譯區 或 第壹個外顯子 ；壹般CpG島序列長度在 500bp 以上， GC含量高於55%以及CpG出現比率大於0.65 ，40%的啟動子區域含有CpG島。
CpG shores 指距CpG島邊緣 2kb 的區域
CpG shelves 是指距CpG島邊緣 4kb 的區域
哺乳動物中的非CpG甲基化主要是發生在胚胎發育階段和腦組織中
基因組中60%-90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG形成CpG島，位於 結構基因啟動子的核心序列和轉錄起始點
壹般來說，DNA甲基化主要作用在於調控基因的表達，即 基因啟動子區域CpG島的甲基化水平越高 ， 其對應基因的表達水平就相對越低 ；DNA甲基化受到 甲基化酶 （如DNMT3A）和 去甲基化酶 （TET2）的調控。
除了CpG島的甲基化水平的變化會導致腫瘤的發生外，CpG shores and shelves的異常甲基化也會導致其基因轉錄水平的抑制
甲基化芯片的原理是 基於亞硫酸鹽處理後的DNA序列雜交的信號探測 ，亞硫酸鹽處理是將 非甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶 ，而 甲基化的胞嘧啶則保持不變 ，然後 再將尿嘧啶轉化為胸腺嘧啶 ，最後進行 芯片雜交 ；
Illumina的450K芯片采用兩種assay：Infinium I和Infinium Ⅱ，前者有兩種bead（微珠），分別是甲基化M和非甲基化U，後者則是壹種bead（不區分甲基化和非甲基化）。
以及下面這張圖，註：左邊壹列是非甲基化的GpC locus，右邊是甲基化的GpC locus，上下分別是Infinium I 和Infinium Ⅱ
探針是以甲基化位點為單位的，每個探針對應檢測壹個甲基化位點。為了能夠區分甲基化位點和非甲基化位點，在450K 和 850K中，有兩種類型的探針，分別叫做I 型探針和 II 型探針
對於human 來說，目前主流的DNA甲基化芯片有450K 和 850K 兩種，都是illumina 公司研發的。這裏的450K 和 850K 指的是芯片上探針的數量，對應可以檢測的甲基化位點個數。
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對於亞硫酸氫鹽處理的DNA ，非甲基化的C會變成T , 而甲基化的C不會變。
對於I 型探針而言，有兩種序列，專業名詞叫做bead type， 其中Unmethylated bead type 用來和非甲基化的C雜交，Methylated bead type 用來和甲基化的C雜交。
對於human而言，主流的DNA甲基化芯片有450K和850K兩種，這兩個數字代表覆蓋到的甲基化位點的個數，是壹個約數；
甲基化芯片上混合使用了I 型探針和II 型探針，I 型探針通過兩個bead type 分別識別甲基化的C和非甲基化的C，II 型探針通過1個bead type 就可以區分甲基化的C和非甲基化的C。
壹、Illumina HumanMethylation450 BeadChip （甲基化450k芯片）簡介
450K芯片的芯片圖形及其原理可以以下圖展示
1、芯片：壹張芯片包括12個array（如圖顯示），也就是壹張芯片可以做12個sample，壹臺機子壹次可以跑8張芯片，也就是壹***96個sample，每個樣本可以測到超過450，000個CpG位點的甲基化信息（大概人所有的1%，但是覆蓋了多數CpG島和啟動子區），芯片本身包含壹些控制探針可以做質控。
2、原理：簡而言之，基於亞硫酸鹽處理後的DNA序列雜交的信號探測。亞硫酸鹽是甲基化探測的“金標準”，不管是芯片或者甲基化測序，都要先對DNA樣品進行亞硫酸鹽處理，使非甲基化的C變成U，而甲基化的C保持不變，從而在後續的測序或者雜交後區分出來。450K采用了兩種探針對甲基化進行測定，Infinium I采用了兩種bead（甲基化M和非甲基化U，如圖顯示），而II只有壹種bead（即甲基化和非甲基化在壹起），這也導致了它們在後續熒光探測的不同，450K采用了兩種熒光探測信號（紅光和綠光）。
二、分析需要考慮的問題
1、背景校正
2、紅光和綠光的校正
3、控制芯片的使用（illumina450K本身有壹些控制芯片，可以用來做質控，如亞硫酸鹽處理效率）
4、探針類型（I型和II型）的校正（不同探針類型產生的數據不同）
最終我們選擇BMIQ的方法（基於ebayes的原理將II型探針的甲基化水平拉伸到I型水平）來做矯正。
5、位置的校正（芯片上的不同位置產生的數據可能會有偏差）
6、批次的校正（不同的批次做的數據會有偏差）
7、探針序列本身是否可靠（有些探針本身位於repeat區或者包含snp等就會影響雜交及最後的結果，應該去除，附上壹片參考文獻，裏邊有list可以用來去除不好的探針）
平均β=信號B /(信號A +信號B + 100)
通過計算甲基化（信號A）和未甲基化（信號B）等位基因之間的強度比來確定DNA甲基化水平（β值）。
具體地，β值是由甲基化（M對應於信號A）和未甲基化（U對應於信號B）等位基因的強度計算的，熒光信號的比率β= Max（M，0）/ [Max（ M，0）+ Max（U，0）+ 100]。
因此，β值的範圍從0（完全未甲基化）到1（完全甲基化）
具體的β值的意義是：
任何等於或大於0.6的β值都被認為是完全甲基化的。
任何等於或小於0.2的β值被認為是完全未甲基化的。
β值在0.2和0.6之間被認為是部分甲基化的。
參考：
/thread-237-1-1.html
/archives/430