後來，政府內倒幕派與德川派的鬥爭漸趨白熱化。1868年1月3日，明治天皇頒布“王政復古大號令”，宣布廢除幕府，並命令德川慶喜“辭官納地”，將壹切權力重新歸於天皇；揭示基本施政方針的「五條禦誓文」則於同年4月6日公布。與此同時，倒幕派組成了新的政府，徹底排除德川派勢力，並以之對抗依舊以江戶為統治核心的幕府。
1867年底，德川慶喜提出“大政奉還”，企圖以退為進。大久保利通等維新派立刻發動“王政復古”政變，並提出了鮮明的戰鬥口號－－“辭官納地”，即要將軍交出所有權力和大部俸祿，從而把幕府逼上了絕路。德川慶喜仗著自己兵力強大及法國的支持，趁夜逃出京都二條城，回到大阪，決心不惜與維新派壹戰。 這時的新選組在土方的改組下已成為壹支法式近代步兵組織，已能夠勝任任何壹場近代戰爭。舊歷1867年十二月十二日傍晚，新選組壹百五十多人奉會津藩主松平容保之命來到伏見奉行所布防。奉行所附近地形開闊，隊士們構築工事，將其變成壹座要塞。預備隊由會津軍事奉行林榷助所率藩兵兩百人擔任。壹旦和薩長土三藩的戰爭開始，這裏就會變成最前線。
緊要關頭，新選組舊傷又發。由於高臺寺黨的殘黨在竹田街道邊的狙殺，身負重傷的近藤和咳血不止的沖田不得不回到大阪城養傷，從而使得新選組的力量進壹步削弱了。
雙方的戰鬥即將開始，現在只是時間問題。不論是德川慶喜，還是近藤、土方，乃至會津藩的步卒，都對幕軍的勝利深信不疑。盡管德川慶喜“大政奉還”後不過是壹方諸候，但此時大阪城內舊幕軍加上會津、桑名兩藩兵馬***有五萬大軍，而盡管薩長土三藩拼命動員，這時在京都也只有五千余兵力。只有那些不懂兵法的普通百姓才會認為戰鬥還沒開始便勝負已定。但這樣的戰鬥，就連京都聯軍總司令官，薩摩藩軍賦役西鄉隆盛也心中沒底。當時幕軍的統帥部制訂了如下方案：首先派遣萬余先鋒軍從大阪直取京都，打垮京都的倒幕軍，然後控制年幼的天皇。大多幕臣認為這便足以結束戰鬥。
舊歷十二月二十五日晚傳來的要求德川慶喜“辭官納地”的消息成了整個戊辰戰爭的導火索。“此次天子敕意如此，乃是奸臣所為。奸臣皆薩摩藩士，舊幕臣甚憂薩摩之真實用意。”大阪城內群情激憤，迅速草擬了以此為中心的《討薩表》。就在京都的公議政體派在為和平解決奔走之時，慶喜認定不可能有和解的希望了，隨後立刻發出命令：“我意已決，全軍覆滅即退守大阪，大阪失即退守江戶，江戶破即退守水戶，徹底抗戰！”1868年舊歷壹月二日，借口進京奏請“辭官納地”，老中松平正質指揮先鋒軍壹萬五千余向京都進發了，大目付堡川俱拳所部高舉《討薩表》走在前列。“島津這下完了！”大阪人目送隊伍出征時紛紛斷言道。三天後，堡川隊八百余人前進到鳥羽中之橋時，薩摩藩五大隊監軍椎原小彌太率部攔住去路進行盤問。黃昏時分，京都方面終於下令討幕，幕軍方面同時由於擔心夜幕會遲滯進軍，下令強行通過，談判徹底決裂。
椎原把右手高高舉起，頓時薩軍陣中軍號長鳴，街道中央的英式大炮立即開火，炮彈直接擊中了幕軍陣地上的壹門大炮。－－戊辰戰爭的第壹炮打響了。兩軍在中之橋附近展開了激烈的戰鬥，與此同時，伏見方向也傳來了激烈的槍聲。這裏的情況與眾不同：雙方都已準備多日，但很明顯這次新選組低估了對手。薩軍的炮兵隊早已排好陣勢，壹上來就對伏見奉行所進行了集火射擊。會津軍和新選組只有四門青銅炮，射程很短，無論從數量上還是質量上都無法相比。薩軍在對面的禦香宮神社與幕軍槍戰，漸占上風。由於裝備上的絕對劣勢，土方不得不下令隊士們進行白刃突擊。
從土方的角度來講，這是他的明智決定。只有趁夜暗突擊過去，發揮出新選組的近戰優勢，消滅對方的炮兵，才能揚長避短，勝利才有希望。但他萬萬沒想到，壹次偶發事件使這道命令成了壹場災難。 新選組隊士在前，會津藩兵在後，冒著猛烈的炮火匍匐前進，眼看勝利在望了。就在這時，最大的不幸發生了。壹發炮彈擊中了奉行所的頂樓，燃起了熊熊大火，把雙方陣地之間的道路照得如同白晝。薩軍發現了偷襲的“白兵隊”，立刻集中火力封鎖了路面。每前進壹步都要付出極大的代價，道路上新選組隊士、會津藩兵屍如山積，慘不忍睹。突擊徹底失敗了，少數突進禦香宮神社的人也只能躲在樹後不敢露頭。淩晨三點左右，土方不得不下令退卻，由新選組作後衛掩護撤退。這時如無援軍則戰鬥下去只有死路壹條。鳥羽的戰鬥還在繼續，池田屋的功臣助勤山崎丞在橋本宿附近也受了重傷。
這壹仗損失慘重：會津兵主將林榷助陣亡，兵士死傷殆盡。新選組裏算上打散的***損失了三分之二以上。伏見、鳥羽戰敗後，德川慶喜出人意料地逃出了大阪，在天保山沖搭乘幕軍軍艦“開陽”號狼狽逃回了江戶。隨後又在當月二十日派海軍把近五萬大軍從海路運回了江戶，其中包括只剩四十五人的新選組。當晚，山崎丞傷重不治身亡，成了日本第壹個以海軍禮儀水葬的人。
伏見鳥羽戰役其實也是壹次以寡擊眾的戰役。幕軍最主要的失敗原因是裝備的落後，加上對手是素以勇猛善戰著稱的薩摩兵。其實如果指揮得當，發揮出幕軍人數上的優勢，與薩軍打近戰、包圍戰而不是陣地戰，勝利還是可能的。德川將軍的臨陣脫逃使得從大阪的反攻成為畫餅，失掉戰機，也是失敗的重要原因。至於新選組，他們在錯誤的地點為了錯誤的原因打了壹場錯誤的仗，就不必多說了。不過他們確實都是壯烈犧牲的。
慶應四年（明治元年，1868），西南外樣藩閥獨裁政府的賊軍，打著“官軍”的旗號，唱著“親王親王禦馬前”的軍歌，大舉進兵關東。東海道諸藩望風而順，竟無壹感懷神祖三百年的君恩而挺身抵抗者。只有近藤勇的甲陽鎮撫隊和人見勝太郎的遊擊隊在甲州和箱根進行了微弱的抵抗，最後，為了免使關東百姓慘遭兵禍，以及防止如狼似虎的列強乘虛而入，大樹德川慶喜公為了日本的未來，忍痛做出了最不情願的抉擇。他斥退了小栗忠順等主戰派，委任勝海舟全權處理恭順事務。在勝的努力下，江戶無血開城。三百年天下，亡了。
根據舊幕的方案，起初是準備將其主力開陽，富士山，蟠龍，朝陽，回天，千代田形，觀光七艦移交明治政府。但是榎本武揚在江戶開城的四月十壹日夜間帶全艦隊退到了安房的館山，本來軍艦移交是江戶無血開城的條件之壹。拿不到軍艦的明治政府又驚又怕，東海道先鋒總督府壹面恫嚇舊幕府方面如果拿不出軍艦，“從寬處置之事”將“悉成泡影。”壹方面又乞求勝海舟盡快解決這件事：“如果駛回品海，向官軍移交，則既往不咎。”責成勝海舟和大久保忠寬盡快解決問題，勝於十六日赴館見同榎本武揚交涉，將明治政府的意誌傳達給榎本武揚，他接受了勸告，於十七日將艦隊帶回了品川。
榎本武揚在伏見鳥羽之戰，以及江戶開城前後是強硬的主戰論者，他是不會輕易屈服於橫暴的西南外樣藩閥政府的，原本他是計劃帶著艦隊突襲西軍的大後方，但是政府的恫嚇起了作用。畢竟這時德川宗家地位未定，為了不給主家處分帶來麻煩，他決心先觀察局勢。
同時，明治政府為了能盡快地接收軍艦，也不得不做出讓步，十九日，總督府指示在慶喜謹慎後負責管理江戶城的田安慶賴，稱榎本武揚“懷念故主，至情感人”，“著令四艦維持現狀，其余四艦迅速上繳天朝。”這對於政府原先先準備接收全艦隊，再酌情賜還壹部的方案來說不可以不說是做了極大的讓步。但是榎本武揚還是不放心——萬壹妳們拿到軍艦之後馬上變卦追討我們怎麽辦啊？總督府再次做出了讓步，表示絕對不用這些軍艦用於追討舊幕軍。榎本武揚才答應可以移交部分軍艦，但是到了移交當天四月二十八日，榎本又不願意了，在幾經催逼之下總算交出了觀光，翔鶴，朝陽，富士四艦，但是捏，作為日本海軍第壹艘軍艦的”觀光“已經和廢船沒有什麽區別，“翔鶴”是沒有作戰能力的運輸艦，朝陽的汽罐故障無法行駛，具有作戰能力的只有富士壹艘了。西軍的海軍先鋒大原俊實壹見到手的竟是這樣壹堆破爛，氣的半死，不願接收。在總督府壹再下命令接受之後，才勉強的把“觀光”以外的三艦拿下。勝海舟在日記裏寫道：“榎本和泉貫徹了夙願”。為什麽呢？因為幕府海軍的精銳壹點也沒有遭到削弱。
這段時候，江戶城內的幕府陸軍也壹再發生脫逃，四月十日，江戶城裏的舊幕軍脫走了兩三千人，他們聚集在下總的國府臺，推舉幕府步兵奉行大鳥圭介為總指揮，之後這支部隊轉戰於下野宇都宮，壬生，日光，今市壹帶，有效的牽制了西軍東山道鎮撫軍的兵力。撒兵頭福田八郎右衛門也在次日率部壹千五百多人開向總州方面。再加上盤踞在江戶上野寬永寺的彰義隊。他們都有效牽制了西軍的進攻步伐，支援了奧州方面的反政府鬥爭。