western blot如何定量測定細胞中某蛋白表達量？

Western blot（蛋白質印跡法）通常用於定性分析蛋白質的存在以及研究它們在不同條件下的表達變化。其大致步驟如下：

1.樣品制備:

使用合適的裂解緩沖液將細胞裂解，並使用蛋白質濃度測定方法（例如BCA或Bradford法）測定蛋白質總濃度。

2.SDS-PAGE:

根據預期的蛋白大小選擇適當的凝膠，並加載相同量的總蛋白至各通道。

3.轉印:

將SDS-PAGE上的蛋白轉移到PVDF或nitrocellulose膜上。

4.封閉:

使用非特異性的蛋白（如脫脂牛奶或BSA）阻止膜上未結合的部位。

5.主抗體孵育:

使用針對目標蛋白的特異性抗體孵育。

6.次抗體孵育:

使用對主抗體的二抗孵育，該二抗通常與熒光物質或酶標記。

7.檢測:

使用化學發光試劑或其他方法檢測目標蛋白的信號。

8.定量:

使用影像分析軟件，如ImageJ，分析帶的灰度值。為了校正加載差異，經常使用內參蛋白，如GAPDH或β-actin，進行歸壹化。根據得到的灰度值和內參的灰度值，計算目標蛋白的相對表達量。