——QIAGEN(德國凱傑)質粒提取試劑盒
壹、細菌培養物的生長
1. 從瓊脂平板上挑取壹個單菌落，接種到2-5mL含有適當抗生素的LB液體培養基中生長。將液體培養基置於37℃，300rpm的搖床中振蕩8小時。
2. 用LB培養基以1/500~1/1000的比例稀釋含菌落的培養基。若為了獲得高拷貝質粒，用100-200ul含菌落液體培養基接種到100ml LB培養基中；若為了獲得低拷貝質粒，用250~500ul含菌落培養基接種到250ml LB培養基中。讓其在37℃，300rpm的搖床中振蕩12-16小時。
二、細菌的收獲和裂解
1. 在6000×g，4℃條件下離心15min，收獲細菌。
2. 加入10ml Buffer P1重懸細菌。
3. 添加10ml Buffer P2，劇烈晃動離心管4-6次使其徹底混勻，室溫放置5min。
4. 加入10ml冰浴的Buffer P3到此溶菌產物中，晃動離心管4-6次使其混勻。
5. 將溶菌產物倒入針口密封的過濾器中，室溫放置10min，不要插入活塞。
6. 打開針口的密封蓋，輕輕擠壓活塞將溶菌產物過濾到壹新的50ml離心管中。
7. 添加2.5ml Buffer ER到過濾的溶菌液中，充分混勻10次後冰上孵育30min。
三、質粒DNA的純化
1. 將QIAGEN-tip 500的柱子掛在另壹離心管上，加入10ml Buffer QBT，讓管中溶液慢慢滴下排空。
2. 將第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中讓其透過樹脂慢慢滴下。
3. 用2×30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip柱。
4. 再用15ml Buffer QN洗脫DNA，用離心管收集DNA洗脫液。
5. 加入10.5ml異丙醇到洗脫液中使DNA沈澱下來，混勻。15000×g，4℃離心30min，離心後小心倒出上清液。
6. 洗DNA用5ml無內毒素-70%乙醇(添加40ml 96%-100%乙醇到試劑盒的無內毒素水中)，15000×g，4℃離心10min。小心倒出上清液不要碰到質粒。
7. 烘幹離心管底部的質粒5-10min。用500ul無內毒素的Buffer TE重新溶解DNA。