生物學劃分為兩個時代：PCR前時代和PCR後時代，這是《紐約時報》對穆利斯先生發明PCR技術的評價。1983年，Kary B. Mullis提出了PCR技術的構想， 1985年，他們在Science發表了相關的論文。論文由Mullis的同事Randall K. Saiki領銜發表，1988年Saiki等分離純化了Taq DNA聚合酶，並將其應用於PCR反應，使PCR變得更加簡單、易行和穩定，隨後PCR技術迎來了蓬勃發展的時期。PCR根據其分析精度，大致經歷了以下三個階段：（I）終點PCR：定性分析（II）定量PCR：相對定量（III）數字PCR：絕對定量
早期PCR主要用於定性分析，根據反應終點產物的有或無檢測靶標序列存在與否，這種PCR可以稱為終點PCR，在基因鑒定、病原核酸檢測等領域具有廣泛應用。
1990年，Simmonds等就通過對終點產物的梯度稀釋對HCV、HIV等病原體進行了粗略的拷貝數鑒定，這可能是最早的定量PCR研究。不過需要澄清壹下，這裏所說的定量PCR還不是指熒光定量PCR，那時還沒有將熒光物質用於PCR產物的監控。直到1992年，羅氏公司的R Higuchi等在Nature發表論文，介紹了將溴化乙錠（EB）用於PCR產物動態監控的方法，這可能是最早的熒光定量PCR技術了。1996年，ABi公司公布了基於Taqman探針的qPCR技術。1997年，Wittwer等比較了（i）基於雙鏈特異性染料SYBR Green I（ii）基於5’-核酸酶和雙標探針（iii）基於Cy5的分子信標的qPCR的特點。這些研究為後來qPCR的廣泛應用奠定了基礎。
壹般，人們習慣把qPCR分為相對定量和絕對定量，不過本質上來說，qPCR只能用於相對定量，絕對定量的實現往往需要借助“外力”。 PCR擴增是壹種指數擴增，理想狀態下，產物濃度與起始濃度存在如下關系：N T = N 0 ×2 n （N 0 代表起始濃度，N T 代表終點濃度，n代表循環數），對公式兩邊取以對數可得：log N T = logN 0 + n×log2（log代表以自然常數e為底的對數），如果我們把PCR終點的判斷信號固定成壹個統壹的值（即qPCR中的熒光閾值），那麽循環數與起始濃度的對數就成了線性關系，這就是qPCR相對定量的基本原理。不過有兩個因素：（1）人的肉眼無法準確的判斷PCR終點信號，於是出現了特殊的設備—熒光PCR儀；（2）不同的靶標基因的擴增效率不同，因此無法直接比較，因此催生了 ? Ct法。
真正的絕對定量PCR稱為數字PCR（dPCR，1999年Kinzler等首次提出數字PCR的概念），它是在終點PCR和極限稀釋的基礎上通過泊松分布計算得出拷貝數的絕對定量方法。在Simmonds等的研究中，他們通過將DNA分子稀釋到單拷貝，然後根據PCR的終點信號和泊松分布規律，計算了靶標基因的分子數目，不過他們沒有進壹步發展該技術，很長壹段時間內該技術都是以分子計數的特點應用的。dPCR壹方面因受到qPCR的長期壓制，另壹方面受到檢測儀器的限制，直到2006年以後才逐漸顯示出技術復蘇的景象。
1993年，Zachar等在《核酸研究》上介紹了利用PCR對靶標基因進行相對定量的數學原理；2001年，Livak KJ等介紹了2 - ? Ct 法的推導過程，局限性及應用。
當然這些原理很簡單，即使不看論文也很容易理解。因為PCR的指數擴增，當我們把終點的判斷標準固定時，起始模板量高的樣本最先到達，起始模板量低的樣本消耗更多的循環數，並且每相差壹個循環，代表起始濃度相差2倍，即N1/N2 = 2 -(Ct1-Ct2) 。檢測不同樣本時， ? Ct可能受樣本量差異的影響，因此引入了內參基因的校正。內參基因，也叫管家基因或者看家基因，壹般認為他們在生物體不同時空組織中保持恒定表達，那麽兩個樣本內參基因的 ? Ct就代表了樣本量的差異，靶標基因的 ? Ct – 內參基因的 ? Ct即為靶標基因的真實表達量差異，這就是2 - ? Ct 法。
但是有幾個問題需要註意：（1）PCR並非全程都是指數增長期，比較必須在對數擴增期進行（2）壹般默認對數增長期擴增效率是100%，這並不嚴謹，尤其是壹些擴增困難的模板，效率可能與100%差異很大，縱向分析某基因的表達量（如基因A在不同生產階段/不同組織的表達量）時，仍使用2 - ? Ct 可能並不太準確（3）不同靶標基因的擴增效率是不同的，因此橫向比較不同靶標基因時，可能造成較大的誤差。
鑒於此，我們在設計引物時，應該盡可能使靶標的長度、GC%、Tm保持接近，從而保證相近的擴增效率。 PrimerBank 和 qPrimerDB 分別是國外和國內比較優秀的qPCR引物檢索網站，收錄了大量物種的qPCR引物數據，具有壹定參考價值。此外，Pfaffl等(2001)，Rao(2013)等對2 - ? Ct 法進行了壹些校正，采用的方法主要就是通過對同壹模板梯度稀釋進行擴增效率校正，具有壹定參考意義。
qPCR絕對定量有兩種方法：（1）先獲得壹個拷貝數已知的參照基因，再獲得靶標基因與該參照的比值，然後根據已知值獲得檢測樣本的確切數目，從這個角度看絕對定量就是借助了“拷貝數已知”這壹外力的相對定量。1990年，Gilliland等就描述了這壹原理。（2）Simmonds等報道的方法，將DNA模板做極限稀釋，壹直到PCR體系中僅含有壹個模板分子，此時只需要乘以稀釋倍數就可以得到樣本中靶標基因的拷貝數。這壹方法是dPCR的技術原型，在實際操作中很有困難，首先需要很多稀釋梯度，其次普通的10-20uL體系中僅含有壹個模板分子經常很難擴增成功。
絕對定量最廣泛的應用是分子計數，如RNA分子數的精確測定，DNA基因組上的基因拷貝數鑒定等。Southern雜交法是外源基因拷貝數鑒定使用最廣泛的方法，但隨著qPCR技術的不斷發展，基於qPCR絕對定量的拷貝數鑒定的報道逐漸增多，並且大量研究表明qPCR方法與Southern雜交得到的結果基本壹致甚至更加精確。Song等(2002)利用qRT-PCR估計了轉基因玉米愈傷組織和植物中的轉基因拷貝數，該研究還使用Southern雜交重新測量了玉米愈傷組織和植物中的“精確”轉基因拷貝數，結果qRT-PCR的測量結果與“精確”結果有較高相關性，因此，他們認為 qRT-PCR可以作為壹種評估轉基因玉米拷貝數的有效手段。
拷貝數鑒定的關鍵是獲得壹個拷貝數已知的標準品，質粒容易提取和純化，因此常用於構建絕對定量的標準品。把攜帶靶標基因的重組質粒提純到極高的純度，精確測定其核酸濃度，根據公式：N = 6.02 × 10 23 (copy/mol) × M DNA (g) / (DNA length(bp) × 650(g/mol/bp)) 即可計算出標準品拷貝數，式中N代表分子數目，M DNA 代表質粒重量。以此標準品繪制logN與Ct的標準曲線，然後根據靶標基因的Ct值即可反推出靶標基因的精確個數。同時我們要從基因組上選擇壹個基因拷貝時已知的參照基因，按同樣方式繪制標準曲線、進行分子計數，然後測定統壹樣本中把靶標基因與參照基因的分子數，帶入上述公式即可得到靶標基因的實際拷貝數。壹般，應該選擇基因組上拷貝數較低，物種內保守性極高的基因作為參照基因。
拷貝數鑒定具有多種形式，雙標準曲線並不是必需的，如果能夠確認靶標基因與參照基因的擴增效率都接近100%，也可使用2 - ? Ct 法測量靶標基因的拷貝數，林維石等(2013)就通過該方法得到了與Southern雜交壹致的拷貝數鑒定結果。
基因分型的方法有很多，Landegren等(1998)在報道中綜述了多種用於基因分型的技術方法，其中發展到現在應用最為廣泛的就是qPCR法和測序法。測序法最為準確，並且能夠發現新基因型，是基因分型或SNP檢測的金標準，但它比較慢，且操作比較繁瑣。qPCR檢測操作簡單且速度極快，目前有十分廣泛的應用。
qPCR法基因分型的基本原理是：3’-末端不匹配的引物無法正常擴增靶標基因。1989年，Wu等和Newton等先後報道了ASPCR法和法用於檢測等位基因，這種方法容易理解，假設已知SNP位點為A/T，如果3’-A引物PCR產物產生終點信號可判斷為A基因型，3’-T引物產生終點信號為T基因型，兩種引物均產生信號即為雜合型。1995年，Livak等報道了利用不同熒光標記的探針檢測SNP的方法，這種方法中，分別針對兩種基因型設計兩條不同熒光標記的探針，並設置純和基因型的對照，隨著PCR擴增如果熒光信號靠近A參照代表A基因型，靠近B參照代表B基因型，如果位於A和B之間則為雜合型（如下圖）。
2003年，Papp等報道了壹種基於高分辨率溶解曲線的SNP分型方法，這種方法也是基於3’-末端不匹配的引物，A基因型設計正常長度的引物，B基因型則在引物5’端添加10-15bp的高GC序列，經過PCR擴增後，不同基因型產物的Tm就會發生變化，依賴於qPCR儀的高分辨率溶解曲線，可以快速區分基因型。
1995年以後，qPCR相關的研究論文數量呈指數式增長，成為分子生物學最熱門的領域之壹。近年來，隨著分子診斷行業的崛起，qPCR在醫療領域發揮著越來越重要的作用。qPCR在快速發展的同時，也產生了壹些問題，如判斷標準不壹致，檢測精確度沒有統壹標準，RNA檢測假陽性較嚴重等。2009年，多個科研院所及醫療單位合作發布了qPCR的 MIQE指南 ，該指南規範了qPCR的常用術語，如Ct應稱為Cq，RT-PCR應寫作RT-qPCR等，並對分析的敏感性、特異性、精度等進行了規範性要求，此外指南還對樣本處理、核酸提取、逆轉錄、qPCR甚至數據分析都作了詳盡的規範。該指南由9部分組成，***85個參數，以確保以qPCR實驗的實用性、準確性、正確性和可重復性。雖然該指南已經有些年份，但遵守這些規範能夠讓妳的研究更易重復，也有助於審稿人和編輯快速評估妳的稿件。
註：指南的內容和附表可以在這裏獲取： petitive PCR for efficient analysis of multiple samples. Nucleic Acids Res. 1993;21(8):2017‐2018. doi:10.1093/nar/21.8.2017
[8] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402‐408. doi:10.1006/meth.2001.1262
[9] Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
[10] Rao X, Huang X, Zhou Z, Lin X. An improvement of the 2?(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 2013;3(3):71‐85.
[11] Gilliland G, Perrin S, Blanchard K, Bunn HF. Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990;87(7):2725‐2729. doi:10.1073/pnas.87.7.2725
[12] Song P, Cai C, Skokut M, et al. Quantitative real-time PCR as a screening tool for estimating transgene copy number in WHISKERS?-derived transgenic maize[J]. Plant Cell Reports, 2002, 20(10): 948-954. doi: 10.1007/s00299-001-0432-x
[13] 林維石等：利用實時熒光定量比較Ct法檢測轉基因小鼠外源基因拷貝數[J]. 生物技術通訊, 2013, 4(24): 497-500. doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2013.04.012
[14] Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Wallace RB. Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989;86(8):2757‐2760. doi:10.1073/pnas.86.8.2757
[15] Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, et al. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 1989;17(7):2503‐2516. doi:10.1093/nar/17.7.2503
[16] Huang MM, Arnheim N, Goodman MF. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 1992;20(17):4567‐4573. doi:10.1093/nar/20.17.4567
[17] Livak KJ, Marmaro J, Todd JA. Towards fully automated genome-wide polymorphism screening. Nat Genet. 1995;9(4):341‐342. doi:10.1038/ng0495-341
[18] Landegren U, Nilsson M, Kwok P Y. Reading bits of genetic information: methods for single-nucleotide polymorphism analysis[J]. Genome research, 1998, 8(8): 769-776. doi:10.1101/gr.8.8.769
[19] Papp AC, Pinsonneault JK, Cooke G, Sadée W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 2003;34(5):1068‐1072. doi:10.2144/03345dd03