質粒小提的原理和提取過程中的註意事項如下:
質粒提取中,要用新鮮的菌液,可以多次提,處於對數期的菌質粒提取率最高,過度培養的菌可能存在菌死亡有雜質,細菌老化且DNA降解,菌液量也要適當,不然容易裂解不充分,嚴重影響得率和純度。
質粒提取中,P1 要懸浮好菌體,要低溫保存,不然也影響質粒提取效率,P2裏有SDS和氫氧化鈉,是利用強堿來裂解DNA並釋放質粒,所以時間不能太長,且要溫和的顛倒混勻,且不能超過5min,否則可能把DNA也裂解成短片段分子,從而混雜在質粒中。
加入P3,操作多個樣品時,最好每加壹管就混勻壹管,P3加入後能恢復pH,產生的絮狀塊狀沈澱主要是蛋白質,被裂解的質粒仍然能還原,但DNA不能。離心後如果還有蛋白懸浮物,可以再次離心,或者延長離心時間。
WB最好pH為7.5,洗脫時最好將移液槍斜著加入,可以去除管壁鹽分,避免直接垂直加對覆膜有影響,以免降低抽提效率,也可延長洗脫時間,增加洗脫效果。
提取質粒的說明
P1中葡萄糖增大粘度,減少機械剪切力,防止DNA 斷裂並保證菌體懸浮;EDTA是螯合劑,與金屬離子結合,尤其是鈣鎂離子,降低DNase對DNA的降解。
P2中NaOH與SDS可裂解細胞,並使DNA、蛋白變性並形成交聯網狀結構而沈澱去除,堿性太強,所以不能時間太長,沒必要靜置,也不要劇烈震蕩,斷裂的基因組DNA碎片很可能會和質粒混在壹起。