1、初染：用裝片夾夾緊抗酸染色標本采集，滴加石炭酸復紅2-3滴，在火苗高空緩緩加溫，切忌燒開，出現蒸氣即臨時離去，若染色液揮發降低，應加上染色液，以防幹枯，加溫3-5分鐘，待標本采集制冷後自來水清洗。
2、褪色：3%鹽酸乙醇褪色30秒~1分鐘；自來水清洗。
3、復染：用偏堿美蘭水溶液復染1分鐘，水清洗，用吸水海綿吸走後用食油鏡觀查。
抗酸染色的原理
分枝桿菌的細胞壁內含有大量的脂質，包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌壹般不易著色，要經過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結合後，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。
齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復紅牢固結合成復合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當再加堿性美蘭復染後，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細菌及背景中的物質為藍色。