主要內容有：
壹、割遼東半島、臺灣及其附屬島嶼、澎湖列島給日本；
二、賠償日本軍費白銀二億兩
三、開放沙市、重慶、蘇州、杭州為商埠，日本輪船可沿內河駛入以上各口；
四、允許日本在中國的通商口岸開設工廠，產品運銷中國內地免收內地稅。
日本限定必須在壹個月內辦理割讓臺灣的手續，李鴻章請求放寬期限，說：“臺灣已是貴國口中之物，何必著急。”
伊藤博文回答：“還沒有咽下去，餓得厲害！”經過二十多天的談判，日方下了最後通謀，限四天內答復，否則北京必不可保。
清政府被迫全部接受了日方提出的條件。
《馬關條約》是繼《南京條約》以來最嚴重的不平等條約。它給近代中國社會帶來嚴重危害：
壹、臺灣等大片領土的割讓，進壹步破壞了中國主權的完整。這是日本繼俄國之後，對中國領土進行的壹次嚴重的掠奪。它迫使臺灣和祖國隔離，並且刺激了列強瓜分中國的野心。從此之後，帝國主義各國爭相在中國劃分“勢力範圍”，中國的民族危機進壹步加深。
二、巨額的賠款，相當於清政府三年財政收入的總和，這就加劇了中國人民的負擔。清政府無力償還，不得不大量舉借外債，便利了列強通過貸款控制中國的經濟命脈。
三、新的通商口岸的開放，使帝國主義侵略勢力深入到中國內地。
四、允許日本在華投資設廠，其他列強援引“利益均沾”的條款，爭先恐後在中國開設工廠，進壹步掠奪中國的原料和廉價勞動力，嚴重阻礙了中國民族資本主義的發展。
《馬關條約》反映了帝國主義資本輸出、分割世界的侵略要求。外國資本主義對中國的侵略進入壹個新的階段，中國社會半殖民地化的程度大大加深了。
《馬關條約》簽訂以後，帝國主義列強爭奪中國的鬥爭更加激烈。甲午戰爭壹結束，俄國就表示反對日本控制朝鮮和割占中國東北地區，沙皇尼古拉二世主張對日采取強硬政策。俄國政府向各國發出照會，要求各國勸告日本放棄長期占領包括旅順在內的遼東半島的打算。德國表示支持俄國的強硬態度。法國決定同俄德壹起采取聯合幹涉的政策。
俄、德、法三國向日本提出放棄占領遼東半島的警告。與此同時，三國的軍艦在日本附近海面遊戈，對日本進行武力威脅。日本由於在戰爭中耗費巨大，無力對付三國聯合的軍事行動，決定接受“俄、德、法三國政府之友誼忠告，約定拋棄遼東半島之永久領有”。
日本被迫同意將遼東半島歸還中國。但向中國勒索3000萬兩作為交換條件。