近芳幼年隨京劇名家律佩芳學習青衣，10歲起即登臺演唱，曾受陳世鼎、劉玉芳等藝人指教。1945年拜"通天教主"王瑤卿為師，受到王瑤卿悉心教導，並向王瑤卿子侄、梅蘭芳的琴師王少卿學習《宇宙鋒》《鳳還巢》、《霸王別姬》、《奇雙會》、《金山寺》、《貴妃醉酒》等梅派戲。1947年搭譚富英及楊寶森的班掛二牌，上演劇目有《紅鬃烈馬》、《桑園會》、《二進宮》、《三娘教子》、《伍子胥》等王派戲，《貴妃醉酒》、《鳳還巢》等梅派戲。1949年起自己組班在北京、濟南等地演出，上演劇目有《起解·玉堂春》、《紅鬃烈馬》、《孔雀東南飛》、《鳳還巢》、《霸王別姬》、《貂蟬》、《奇雙會》等。1949年9月受李少春先生、袁世海先生邀請，在上海天蟾舞臺與姜妙香先生合演《玉堂春》、《孔雀東南飛》、《奇雙會》、《鳳還巢》等，與李少春先生合演《長板坡》、《法門寺》、《甘露寺》、《野豬林》等，與袁世海先生合演《霸王別姬》等劇目。1949年底經王瑤卿推薦在上海拜梅蘭芳為師，受到梅蘭芳悉心指教。也曾問藝於徐蘭沅、周昌泰、姜妙香等與梅蘭芳合作過的前輩或琴師。1951年加入中國戲曲研究院京劇實驗工作團(中國京劇院前身)，長期與李少春、袁世海、葉盛蘭等藝術家同臺合作演出。
早期為其操琴的琴師是周國興，1979年10月以後的琴師是李門、李超，合作鼓師是賡金群。
杜近芳憑著先天的聰穎和對京劇藝術的執著追求，創造了大量感人至深的舞臺藝術形象。50、60年代她主演的《柳蔭記》、《白蛇傳》、《玉簪記》、《桃花扇》、《白毛女》、《西廂記》、《佘賽花》、《謝瑤環》、《柯山紅日》等新編或改編戲充分展示出她深厚的傳統戲功底和創作演出新編戲的能力。杜近芳與李少春、袁世海合演的古裝戲《野豬林》(1962年)和主演的現代戲《紅色娘子軍》(1972)都被拍攝成了彩色京劇影片。1976年以後，中央新聞紀錄電影制片廠又先後將其《斷橋》、《廉錦楓·刺蚌》、《謝瑤環·花園》等攝制成了戲曲片。