原位雜交是應用核酸探針與組織或細胞中的核酸按堿基配對原則進行特異性結合形成雜交體，然後應用組織化學或免疫化學方法在顯微鏡下進行細胞內定位或基因表達的檢測技術。操作步驟如下：
(1)載片的清潔與處理載片的清潔很重要，特別不能有核酸酶的汙染。為了在後續的雜交和沖洗等步驟中防止組織或細胞從載片上脫落，可以用多聚賴氨酸塗抹載片。
(2)組織與細胞的固定進行原位雜交的細胞或組織必須經過固定處理，常使用4%的多聚甲醛
(3)探針對探針的設計與方法根據被測定的核苷酸序列來決定。同時為了探針的滲入，用於細胞與組織原位雜交的探針均比較短，而用於細胞染色體原位雜交，常使用較長的探針以增強雜交的信號。
(4)濕盒原位雜交中每張標本所用的雜交液比較少，為防止雜交體系中的液體蒸發造成雜交液濃縮，甚至幹燥，故應該使用濕盒。
(5)細胞組織雜交前處理原位雜交遵循核酸雜交的壹般原則，但不同的是由於組織和細胞中的核酸都與細胞內的蛋白質結合，以核酸蛋白復合體的形式存在，固定過程中固定液的交聯作用使生物分子形成網格，影響探針的穿透力，阻礙雜交體的形成，因此必須使用去汙劑和/或蛋白酶對組織和細胞進行部分消化以除去核酸表面的蛋白質，使探針獲得最大的穿透力。