前言
細胞雕亡通常稱為細胞程序性死亡，是由基因控制的主動性細胞死亡過程。越來越多數據發現，細胞雕亡與多種疾病密切相關，如癌細胞具有連續增殖、抵抗細胞雕亡能力，利用流式細胞儀分析細胞雕亡可為腫瘤診斷，療效評價和預後預測提供了重要的參考指標。然而很多實驗的同學們，常會碰到上機檢測時細胞死亡太多卻檢測不出雕亡，多次重復結果不壹致等現象，本文就壹起看看如何把細胞雕亡的數據變的更加漂亮，準確！
首先，明確壹下細胞雕亡和壞死的區別
細胞雕亡(apoptosis) 是壹件主動性細胞死亡事件，它涉及壹系列基因的激活、表達以及調控，是細胞為更好地適應環境而主動爭取的壹種死亡過程。 具體表現為： 出芽形成雕亡小體、核小體間DNA的切割，雕亡小體被吞噬和消化等幾個連續過程等[1]（如下圖所示）。
圖1：細胞雕亡的發生過程[1]
細胞壞死（necrosis） 則是壹件被動的過程，是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程，即病理條件下，自體損傷的壹種現象。 具體表現為： 細胞脹大，胞膜破裂，細胞內容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，會引起局部嚴重的炎癥反應（如下圖所示）。
圖2：細胞壞死的發生過程[1]
壹、流式檢測細胞雕亡的原理
Annexin V和PI雙染法是流式檢測細胞雕亡的經典方法 ，它是基於雕亡的早期細胞膜上的磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine, PS）從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面這壹原理來實現的（如下圖3）。
圖3：雕亡早期 PS從細胞膜的內側外翻
該方法簡便、快速、準確區分活細胞、雕亡細胞和壞死細胞，具體原理如下：
因此，將Annexin V與PI聯合使用時，便可用來鑒別活細胞，雕亡細胞及死亡細胞。
二、實驗操作步驟
三、數據分析
Annexin V-FITC/PI雕亡檢測試劑盒是用FITC標記的Annexin V作為探針，FITC最大激發波長為488 nm，最大發射波長525 nm，FITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI-DNA復合物的最大激發波長為535 nm，最大發射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。通過軟件分析，繪制雙色散點圖，FITC為橫坐標，PI為縱坐標。
如下圖所示：細胞可以分為4個象限：
圖4：4個象限的細胞分布圖
舉例：如常用於研究藥物或者基因等對細胞雕亡的影響。 通過比較Control組和藥物組，發現化合物可以誘導前列腺癌細胞系PC-3M的細胞雕亡，處理組（20μM）的晚期雕亡細胞比例與Control組（0μM）相比，從1.79%上升到11.39%。進而還可根據每個象限的數據計算出活細胞、雕亡細胞和壞死細胞百分率。
圖5. 藥物濃度梯度依賴性的誘導PC-3M細胞雕亡[2]
四、常見問題解答
1. 如何避免出現假陽性結果？
2. 為什麽必須收集細胞上清？
因為雕亡的細胞可能會脫壁，懸浮於培養基，所以必須收集上清再離心取沈澱，合並胰酶消化下來的細胞，不然檢測出來的雕亡比例可能會減少。
3. 為什麽在染色後1h內就要上機檢測？
由於細胞雕亡是壹個快速的過程，建議樣品在染色後1小時之內進行分析；PI受時間的影響很大，因標記了PI後會加大細胞毒性，特別是檢測早期雕亡時，如果時間延長除了會導致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外，誤差會明顯加大，所以建議在壹個小時內檢測。
4. 其他註意事項
參考文獻：
[1]Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007;35:495-516.
[2]Qin M, Peng S, Liu N, et al. LG308, a Novel Synthetic Compound with Antimicrotubule Activity in Prostate Cancer Cells, Exerts Effective Antitumor Activity.[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2015,355(3): 473-483.