引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源。
② 產物不能形成二級結構。
某些引物無效的主要原因是引物重復區DNA二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。
③ 引物長度壹般在15~30堿基之間。
④ G+C含量在40%~60%之間。
⑤ 堿基要隨機分布。
引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超 過3個連續的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。
⑥引物自身
引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾狀結構牙引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補堿基不能大於3bp。
⑦引物之間
兩引物之間不應不互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。壹對引物間不應多於4個連續堿基的同源性或互補性。
⑧ 引物5′端可以修飾。
引物的5′端限定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入壹啟動子序列等。
⑨ 引物3′端不可修飾。
引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應中，引物3′端不能發生錯配。
⑩ 引物3′端要避開密碼子的第3位。
如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡並，會影響擴增特異性與效率。