做差壹位排列組合探針設計即便是。
DNA分子結構中,兩條多脫氧核苷酸鏈圍繞壹個***同的中心軸盤繞,構成雙螺旋結構。脫氧核糖-磷酸鏈在螺旋結構的外面,堿基朝向裏面。兩條多脫氧核苷酸鏈反向互補,通過堿基間的氫鍵形成的堿基配對相連,形成相當穩定的組合。
脫氧核糖核酸(DNA)是生物細胞內攜帶有合成RNA和蛋白質所必需的遺傳信息的壹種核酸,是生物體發育和正常運作必不可少的生物大分子。
DNA中的核苷酸中堿基的排列順序構成了遺傳信息。該遺傳信息可以通過轉錄過程形成RNA,然後其中的mRNA通過翻譯產生多肽,形成蛋白質。
如何設計原位雜交的探針1.探針分為好多種,妳要先決定妳用何種,是RNA探針還是DNA探針,雜交時,RNA-RNA結合的穩定性要比DNA-RNA好,所以RNA探針具有結合牢固、背景低等優點;DNA探針背景稍微深壹些,不過也可以,標記方法比前者簡單壹些,另外還有寡核苷酸探針,此類探針分子量小,通透性好,但就是標記的敏感性不高。
2.原位雜交相比免疫組化,定位相對準確,但如果蛋白在間質中發揮作用,原位雜交就檢測不出來了,結合圖像分析,原位雜交也可以對目的基因的轉錄半定量。
3.首先是標本對照,這個包括陽性對照和陰性對照;第二個是探針對照,主要是明確探針的特異性;第三個是探針正義連陰性對照,第四個未標記探針競爭抑制;第五個不含探針的陰性對照;第六個質粒對照,第七個無關探針對照。
4.若要定量,該試驗不可行,還是作Northern,若要顯示形態、定位,最好結合免疫組化。
2020-11-05Taqman探針的設計及熒光基團的選擇總原則:探針選擇要保守,引物選擇要保守,因此必須找壹段100-200bp相對要保守的片段來設計引物與探針。即real-timePCR的擴增片段是50bp-150bp。當找不到150bp的保守片段時,必須確保探針的片段是保守的。
在設計探針和引物時,要同時考慮在兩條鏈上設計引物與探針。但要註意的是,在哪條鏈上設計探針時,就應靠近在同壹條鏈上設計的引物(即上遊引物)。這樣,可保證在將來擴增時,即便沒有完全擴增,也有熒光信號報告出來。兩者的距離最好是探針的5'端離上遊引物的3'有壹個堿基,但也可以重疊。
若在原序列中找不到合適的探針與引物(1主要是探針和上遊引物的距離太遠,而離下遊引物的距離卻較近時;2突變位點要求在探針的5'端也能檢測到熒光信號,但卻是在3'端),可在互補的序列中設計引物與探針。
另real-timePCR中的探針和引物的Tm值,均要高於平常PCR的引物和雜交的探針的Tm值。
二、探針的設計
探針設計的基本原則:
1.保守:探針要絕對的保守,有時分型就單獨依靠探針來決定。理論上有壹個堿基不配對,就可能檢測不出來。若找不到完全保守的片段,也只能選取有壹個堿基不同的片段。且這個不同的堿基最好在探針的中間,對探針與目的片段的雜交影響不大,不相同的堿基最好不要在兩端,因為兩端不利於探針的雜交。且最好為A或T,而不能為G或A,因為A、T為雙鍵,而G、A為三鍵。
2.探針長度
Taqman探針的長度最好在25-32bp之間,且Tm值在68-72℃之間,最好為70℃,確保探針的Tm值要比引物的Tm值高出10℃,這樣可保證探針在退火時先於引物與目的片段結合。因此探針最好是富含GC的保守片段,保證其Tm值較高。現在有TaqmanMGB探針,在TAMER之後再標記壹個MGB,可使探針的Tm值較高,即使探針片段較短,也可達到Taqman探針的Tm值要求(68-70℃)。
3.探針的名稱
應標記探針在基因組的位置及長度。
4.探針Tm值計算
用oligo或primerpreiemer軟件即可計算Tm值。確保探針中GC含量在30-80%。應避免探針中多個重復的堿基出現,尤其是要避免4個或超過4個的G堿基出現。
5.探針的評價
用DNAstar軟件中的Primerselect軟件,點擊“log”菜單中的“createprimercatalog”,在“name”中輸入探針的名稱、位置,按Tab鍵進入“sequence”,粘貼或輸入要分析的探針序列。選中整個序列後,在“report”菜單下“primerselfdimer”,分析探針的二聚體。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個dimer,並對此探針用dG值進行評價(通常給出最差的dG值,理論上是dG值越大越好)。在“report”菜單下“primerhairpins”,分析探針的發夾結構。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個hairpins,並對此探針的hairpins進行評價。多重熒光PCR時,要對多條探針進行“pairdimer”進行分析。
6.探針的5'端不能為G,因為即使單個G堿基與FAM熒光報告基團相連時,G可以淬滅FAM基團所發出的熒光信號,從而導致假陰性的出現。
7.Taqman探針與引物之間的位置
Taqman探針應靠近上遊引物,即Taqman探針應靠近與其在同壹條鏈上的上遊引物。兩者的距離最好是探針的5'端離上遊引物的3'有壹個堿基,但也可以重疊,要保證Taqman探針的5'端離上遊引物的5'端至少有4bp。
三、探針熒光基團的選擇
壹般5'端的發光基團可以根據妳的需要選擇,理論上,5'端標記的熒光受設備激發發射的波長應該是3'端的激發波長,所以如果妳5'端用的是FAM(最常用的熒光染料之壹),而FAM受激發發射的中心波長是521nm,這樣3'端就要選擇激發波長在521nm左右的熒光染料(淬滅基團)。淬滅基團受激發後也會發射熒光,即背景熒光,對檢測帶來噪聲,所以現在3'端也較常使用不發光的淬滅基團如Eclipse,可以降低背景幹擾。
[圖片上傳失敗...(image-57546e-1604560497296)]
[圖片上傳失敗...(image-b694b9-1604560497296)]
四、MGB探針的優點
a.MGB探針較短(14-20bp),更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區。
b.短片段探針(14-20bp)加上MGB後,Tm值將提高10℃,更容易達到熒光探針Tm值的要求。
MGB探針的設計原則:
1)探針的5'端避免出現G,即使探針水解為單個堿基,與報告基團相相連的G堿基仍可淬滅基團的熒光信號。
2)用primerexpress軟件評價Tm值,Tm值應為65-67℃。
3)盡量縮短TaqmanMGB探針,但探針長度不少於13bp。
4)盡量避免出現重復的堿基,尤其是G堿基,應避免出現4個或4個以上的G重復出現。
5)原則上MGB探針只要有壹個堿基突變,MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交,不產生熒光信號)。因此,在進行SNP檢測時,為了檢測到突變子,即TaqmanMGB不與目的片段雜交,不產生熒光信號,探針目的片段產生熒光信號檢測將探針的突變位點盡量放在中間1/3的地方。註意:為了滿足上述要求的4個條件,探針的突變位點可向3'端移動,但突變位點至少在離3'端2個堿基的前方(即必須確保探針的後兩個堿基是絕對的保守),以進行SNP檢測。反過來,若要進行同類檢測,找的是保守片段區,探針中不應有突變位點。若探針即便是只有13個bp,探針仍不完全保守。有幾個突變,突變位點也應靠近探針的5'端,這樣,即便是突變,探針也可與目的片段雜交,產生熒光信號。另壹種方法是設計簡並探針,也可達到即使是突變,仍可檢測到突變。
五、引物的設計
1.上下遊引物要保守
為了能夠擴增出所需要的保守片段,必須對保守的100-200片段進行PCR擴增。所以引物的選取也要非常的保守,最好不要有不同的堿基,若不得不有時,也必須保證引物的3'端至少有4個堿基是完全保守才可。
在設計保守引物時,要在發表序列上分別找保守壹致的區域,即在發表序列的5'端引物位置找的是3'端至少有5個bp保守,在即在發表序列的3'端引物位置找的是5'端至少有5個bp保守。
2.上下遊引物的長度和Tm值
上下遊引物的長度壹般為18-25bp之間,且Tm值在58-60℃之間。確保引物中GC含量在30-80%。應避免引物中多個重復的堿基出現,尤其是要避免4個或超過4個的G堿基出現。引物的3'端最好不為G或/和C。引物3'端的5個堿基不應出現2個G或/和C。
上遊引物應標記F(forword),且在基因組的位置及長度;下遊引物應標記R(reverse),且在基因組的位置及長度。用oligo或primerpreiemer軟件即可計算Tm值。上下遊引物的Tm值相差最好不超過2℃,長度相差最好不超過4bp。
3.引物的評價
用DNAstar軟件中的Primerselect軟件,點擊“log”菜單中的“createprimercatalog”,在“name”中輸入引物的名稱、位置,按Tab鍵進入“sequence”,粘貼或輸入要分析的引物序列。選中整個序列後,在“report”菜單下“primerselfdimer”,分析引物的二聚體。彈出的窗口中就告訴此引物有多少個dimer,並對此引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值,理論上是dG值越大越好)。在“report”菜單下“primerhairpins”,分析引物的發夾結構。彈出的窗口中就告訴此引物有多少個hairpins,並對此引物的hairpins進行評價。再選擇所需要的上下遊引物,在“report”菜單下“primerpairdimers”,分析上下遊引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer,並對此對引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值,理論上是dG值越大越好(dG值通常為負值),絕對值超過4.5kcal/mol易導致產生引物二聚體帶,並且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行)。不必考慮引物與探針之間的配對與發夾結構,因為探針的Tm值非常之高。
4.上下遊引物與探針的距離(上下遊引物的位置)
理論上講,上遊引物的3'端離探針的5'端為1-20bp,最佳是1bp,最近為上遊引物的3'端離探針的3'端為4bp;下遊引物要與探針有壹定的距離,但要保證下遊引物的3'端離探針的3'端最好為15-150bp。整個目的片段的長度最好在50-150bp之間,最長不超過200bp。
5.簡並引物的設計
當為了能夠同時擴增即使在引物位點也有突變的目的片段,若多個堿基出現的概率相同,就要在此位點,設計壹個代表多個堿基的簡並子。在合成引物時,在合成到此位點時,就不是加入壹個堿基,而是同時加入簡並子所代表的多個堿基。這樣,實質合成的引物是多條引物,只不過是在簡並子位置堿基不同而已。但簡並引物要考慮每條引物的Tm值,確保簡並子所代表的不同堿基的不同引物Tm值相差不超過2℃。若超過2℃,在確保引物的3'端引物相同時,在Tm值較低的堿基引物的5'端加入幾個堿基,使其的Tm值相同。但這時就不是簡並引物,而是分別合成長度不同,簡並子位點堿基不同,但Tm值相同的兩條引物,最後在進行等濃度的混合即可。
六、實時多重PCR探針的選擇
1.多重實時PCR的多種含意有兩種:壹為選擇保守的探針和引物,利用不同的染料標記探針,在檢測時可根據熒光的顏色來判定不同的產物。另壹種為選擇保守的引物,擴增不同長度的目的片段,反應中加入SYBRN染料,最後根據不同目的片段的Tm值來判定不同的物品。
2.多重實時PCR的熒光探針應為同壹類型:如同時為Taqman探針、或同時為MGB探針、或同時為Beacon探針。
3.在多重PCR中,多重PCR的各個引物之間相互幹擾和各個探針之間相互幹擾分析。
設計好各對引物和探針後,重新再用DNAstar軟件中的Primerselect軟件,打開保守在同壹文件中的多重PCR的引物文件,然後兩兩分別選中所設計的多重引物或兩兩分別選中所設計的多重探針後,在“report”菜單下“primerpairdimers”,分析上下遊引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer,並對此對引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值,理論上是dG值越大越好)。
4.多重實時熒光PCR擴增片段影響
最好每重擴增相同長度的目的片段,但長度不宜相差太大。
5.同種亞型明顯分為幾群,而又想同時擴增整個亞型的引物與探針設計策略。
先對各個亞群設計各自保守的引物與探針,然後探針用同壹染料標記,這樣在實時PCR反應中,雖然是多重PCR反應,但報告卻是同壹個染料報告。
參考,
,