什麽是酶聯免疫吸附試驗？

酶聯免疫吸附試驗 酶聯免疫吸附試驗 (以下簡稱ELISA) ：是酶免疫測定技術中應用最廣的技術。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應板 ) 表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的遊離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用於檢測大分子抗原，後者用於測定特異抗體。 自從Engvall和Perlman（1971）首次報道建立酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA）以來，由於ELISA具有快速、敏感、簡便、易於標準化等優點，使其得到迅速的發展和廣泛應用 。盡管早期的ELISA由於特異性不夠高而妨礙了其在實際中應用的步伐，但隨著方法的不斷改進、材料的不斷更新，尤其是采用基因工程方法制備包被抗原，采用針對某壹抗原表位的單克隆抗體進行阻斷ELISA試驗，都大大提高了ELISA的特異性，加之電腦化程度極高的ELISA檢測儀的使用，使ELISA更為簡便實用和標準化，從而使其成為最廣泛應用的檢測方法之壹。 目前ELISA方法已被廣泛應用於多種細菌和病毒等疾病的診斷。在動物檢疫方面，ELISA在豬傳染性胃腸炎、牛副結核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍舌病等的診斷中已為廣泛采用的標準方法。 (壹) 基本原理 ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子***價結合，此種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發生特異性結合。滴加底物溶液後，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，使ELISA方法成為壹種既特異又敏感的檢測方法。 (二) 用於標記的酶 用於標記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩定；反應產物易於顯現；能商品化生產。目前應用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用最廣。 1.辣根過氧化物酶（HRP） 過氧化物酶廣泛分布於植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的壹種糖蛋白（含糖量18％），分子量約40 000，約由300個氨基酸組成，等電點為pH 3-9，催化反應的最適pH值因供氫體不同而稍有差異，壹般多在pH 5左右。此酶溶於水和50％飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。 酶的純度以RZ表示：RZ＝OD403/OD275 純酶的RZ多在3.0以上，最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75％，不能用於標記。RZ在2.5以上者方可用於標記。HRP的作用底物為過氧化氫，催化反應時的供氫體有幾種：（1）鄰苯二胺（OPD），產物為橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應，顏色可在數小時內不改變,是目前國內ELISA中最常用的壹種；（2）聯大茴香胺（OD）,產物為橘黃色，最大吸收值在400nm，顏色較穩定；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產物為深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性較差；（4）鄰聯甲苯胺（OT）產物為藍色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不穩定，不耐酸，但反應快，顏色明顯。 2.堿性磷酸酶 系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價無毒性。酶解產物呈黃色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應系統中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為壹個單位。 (三) 抗體的酶標記方法及標記效果測定 1.標記方法 良好的酶結合物取決於兩個條件：即高效價的抗體和高活性的酶。抗體的活性和純度對制備標記抗體至關重要，因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價高及抗原親和力強的抗體球蛋白，最好使用親和層析