和其他真菌壹樣,木黴經過營養體生長後,便進入繁殖階段,經過繁殖產生許多新個體,延續其種群,木黴的繁殖方式包括有性繁殖和無性繁殖兩類,不同的繁殖方式產生不同類別的繁殖體,主要的繁殖體類別有無性階段的分生孢子和厚垣孢子及有性階段的子囊孢子。從繁殖意義上來說,菌絲段、子座等可發育為菌絲的結構也可稱繁殖體。有性繁殖需要不同交配型的細胞配合,以細胞核結合為特征,無性繁殖是指不經過兩性細胞的配合便能產生新的個體,即以營養繁殖為特征。利用分子生物學手段,研究者目前已經發現部分木黴的有性階段,如楊合同《木黴分類與鑒定》壹書即列出了48個木黴種類具有相對應的有性型及52個無性型為木黴形態的肉座菌種類。在自然界中有些木黴常以無性階段存在,多分布於土壤、有機肥、空氣等環境中,是主要的土壤習見菌;有些木黴兩種形式都存在,如T.reesei和哈茨木黴(T.harzianum)等,無性階段同上,而有性階段多見於樹皮、枯木或高等真菌的老齡子實體上,並以腐生形式存在;有些木黴則多以有性階段存在,但可通過人工培養發現其無性形態。
3.2.2.1 木黴的無性繁殖
木黴的無性繁殖可概括為兩種:①菌絲體的斷裂片段可以產生新個體,大多數木黴能進行這種無性繁殖,實驗室“轉接”培養就是利用這壹特性來繁殖菌種,特別是針對壹些不產孢或產孢量極低的菌種。②產生無性孢子,每個孢子可萌發產生新個體。
無性繁殖過程所產生的孢子稱無性孢子,木黴的無性孢子有兩種,分生孢子和厚垣孢子。其中,分生孢子的形狀、顏色、著生方式、大小等特征是木黴分類鑒定的重要依據。
分生孢子是由特化的菌絲先端通過壹定方式發生的。以T.harzianum為例,2004年,胡東維等通過超微結構觀察,揭示了其分生孢子的發育過程。分生孢子生產木黴的瓶體式的產孢細胞,屬於全壁芽生瓶梗式產孢,首先形成分生孢子壁。初始階段,分生孢子和產孢分生孢子的細胞壁是連續的,進壹步發育後產孢細胞的頂部外壁部分會破裂,分生孢子不斷被釋放,分生孢子在初級發育階段表面是平滑的,成熟後表面產生了許多具泡狀隆起或疣狀突起。產孢細胞瓶型又稱瓶梗,通常直接著生於分生孢子梗上,或著生於分生孢子梗的二級分枝,呈輪狀排列,較少單生,其排列著生方式是木黴分類的重要依據之壹。瓶梗下方的特化菌絲稱分生孢子梗。木黴的分生孢子梗在多數種類中有粗直或者鋸齒狀的主軸,初級分枝間距規則,有二級分枝,二級分枝也可以再次分枝,並且有連續的再次分枝,隨著分枝次數的增加,在頂端或者遠端變短並變細,分枝近似二歧式,或者單生、對生或者輪生。某些種通過重復的輪狀分枝形成高度分枝的金字塔形結構,在分生孢子下面的常常是細的短柱形頸。總體上,木黴的分生孢子梗按照分枝形式可以分為4種類型,即粘帚黴型(Gliocladium-like)、厚基孢型(Pachybasium-like)、輪枝菌型(Verticillium-like)和木黴型(Trichoderma-like)。分生孢子梗的分枝形式是鑒定木黴的重要形態指標。
厚垣孢子是在菌絲中間或頂端發生的局部細胞質濃縮和細胞壁加厚,最後形成壹些厚壁的休眠孢子,由斷裂方式產生,壁厚,壽命長,能抗禦不良外界環境,又稱厚壁孢子。厚垣孢子能以休眠的方式使真菌度過環境相對惡劣的時期,環境條件適宜時,厚垣孢子萌發形成菌絲。通過形成厚垣孢子也可以達到擴大菌體個數的作用,這與其他類型孢子的作用相類似。過去曾認為它們是在不良條件下的產物,但事實證明,有些菌絲在正常情況下也可產生厚垣孢子,並可隨時萌發產生芽管。木黴菌常常形成厚垣孢子,產生於基內菌絲上、產量較大,壹般間生,或者在營養菌絲側枝的尖端端生,圓形或橢圓形,無色至淺黃色,其大小約是分生孢子的兩倍(楊合同,2009)。木黴屬厚垣孢子,在土壤中存活能力要優於分生孢子。多數木黴可以在壹定條件下產生厚垣孢子,常見的種類有長枝木黴(T.longibrachiatum),T.harzianum,康寧木黴(T.koningii),T.reesei,綠木黴(T.virens),T.viride等,T.virens甚至可在幼齡培養基中產生厚垣孢子,木黴菌株培養產生厚垣孢子的數量不僅受培養基、培養溫度、裝瓶量、初始pH 值的影響,而且與菌種、菌株水平上的差異密切相關。如顧金剛等(2008)發現長枝木黴和T.harzianum在玉米稭稈粉培養基中可以產生大量的厚垣孢子,但在玉米粉或PDA培養基中則主要為分生孢子或僅產生少量的厚垣孢子。此外,不同菌株之間的差異非常大,長枝木黴ACCC30150厚垣孢子產生的數量遠遠低於T.harzianum ACCC30371,兩者之間可相差壹個數量級。也有壹些木黴尚未發現產厚垣孢子,常見的如黃綠木黴(T.aureoviride)。
3.2.2.2 木黴的有性繁殖
通過性結合而產生孢子的繁殖方式稱有性繁殖,以細胞核的結合為其特征。性結合過程分三個階段:質配→核配→減數分裂。①質配:首先是兩個細胞的原生質進行配合。②核配:兩個細胞裏的核進行配合。真菌從質配到核配之間時間有長有短,這段時間稱雙核期,即每個細胞裏有兩個沒有結合的核,這是真菌特有的現象。③減數分裂:核配後進行減數分裂,減數分裂使染色體數目減為單倍。在核配以後,雙倍體的細胞核進行減數分裂,然後形成有性孢子,所以,有性孢子的細胞核處於單倍體階段,即木黴有性階段形成的子囊孢子是單倍體。
木黴的有性階段肉座菌是較高等的子囊菌,它們通過異型配子囊配合後產生。子囊的形成過程稱鉤狀形成方式。有性過程的初期先在菌絲上分化出雌性的產囊體和雄性的雄器,它們各自含多核。兩個異性細胞接觸後雄核及其細胞質轉入產囊體,異性細胞核兩兩相配。由產囊體上生出許多產囊絲,並有多對核進入產囊絲內。產囊絲生長到壹定長度後頂端鉤狀彎曲呈環形,在原產囊絲中和鉤尖部分各生出壹個橫隔。鉤頂細胞中含有兩個不同性別的核,並由此發育成子囊。在子囊內兩核融合,經過壹次減數分裂和壹次有絲分裂,最後形成8個單倍體的核。每個細胞核周圍產生膜包圍細胞質和細胞核,並逐漸產生細胞壁發育成子囊孢子,這些子囊孢子再經過壹次有絲分裂形成16個分孢子,這也是木黴子囊的典型特征之壹(圖3.2)。由於在壹個產囊體上可以生長許多產囊絲,每根產囊絲在發育出鉤頂細胞後,仍可以側生分枝發育另壹個產囊絲,所以,最後許多子囊叢生在壹起。它們常常被許多不孕的菌絲細胞包圍而形成具有壹定形狀的子囊果。木黴有性階段的子囊果具有明確的子囊殼壁,著生於子座中,形狀有球形、梨形等,常有頸部和孔口,稱子囊殼。子囊單層壁,頂端有不同結構,棍棒形或圓柱形,常束生、平行排列於子囊殼內,有側絲或側絲早期消解。子囊孢子成熟後靠子囊吸收水分增加膨壓,強力使子囊果破裂,或者通過子囊上特定的孔口釋放。釋放的子囊孢子在合適的條件下萌發芽管,逐漸長出新的菌絲體。
3.2.2.3 木黴的交配型基因
真菌的有性結合是個比較復雜的問題,它們的發生需要各種條件。目前,在真菌中有性繁殖的發生有兩種情況:壹種為同宗配合,另壹種為異宗配合。凡同壹菌絲體上產生的不同性細胞能結合產生有性孢子的稱同宗配合,而需要不同性別的菌絲結合才能產生有性孢子的為異宗配合。此外,它們的性結合往往由壹對或兩對等位基因決定。這些交配型基因控制其交配親和性和有性生殖。
圖3.2 木黴的子囊孢子和分孢子
標尺:5μm
(Priscila et al.,2003)
目前,研究發現子囊真菌有壹個單壹的交配型基因位點(MAT locus)控制有性生殖階段。包含兩個交配類型,MAT1-1和MAT1-2。這些MAT基因占據相同的的染色體位置,但缺乏序列相似性,這兩個完全不同的序列稱特異型(idiomorphs),而不是等位基因。壹般情況下,壹個特異型上含有壹個或多個開放閱讀框。其中,壹個特異型的開放閱讀框的編碼壹個含有HMG-box結構域的DNA結合調節蛋白質;另壹個編碼產生壹個具有alpha-box結構域的蛋白質,交配型基因的主要產物是轉錄因子(TF)。其蛋白質的保守區域具有DNA結合結構域。
圖3.3 H.jecorina的交配型idiomorphs基因
註:MAT1-1位點長度5.5kb,包含MAT1-1-1,MAT1-1-2和MAT1-1-3三個基因,MAT1-2位點長度為4.3kb,包含壹個MAT1-2-1基因。方框表示基因的外顯子,黑線部分表示內含子連接。兩種交配型的菌株都有MAT1-1-1的3′端,用灰色的框表示
(Seidl et al.,2009a)
木黴交配型的研究主要聚焦在T.reesei中,目前,研究人員已經實現了人工條件下的有性發育過程,並鑒定了不同T.reesei菌株的交配型,發現T.reesei QM6a為MAT1-2交配型,其必須與具有MAT1-1交配型的菌株進行雜交才可完成相互識別,並誘導T.reesei QM6a獲得受精子座和成熟的子囊孢子(圖3.3 是T.reesei有性型H.jecorina的交配型)。此外,在T.atroviride和T.virens基因組中也發現了相關的MAT1-2交配型位點。
在T.reesei有性生殖過程中信息素扮演了重要的角色。已經發現的T.reesei的有性型有兩套信息素前體-信息素受體系統,分別為HPR1-HPP1和HPR2-PPG1,其中,HPP1和PPG1賦予雄性繁殖力,但僅在交配發生時兩個信息素受體系統HPR1-HPP1和HPR2-PPG1分別賦予其同源交配類型MAT1-1或MAT1-2母本繁殖力並誘導子實體的形成。此外,信息素受體對子囊孢子的形成也是必不可少的,表明其參與了T.reesei有性受精後事件。在同源交配型雜交發生時,如果僅存在信息素受體,雖然也可形成類似子實體的雌性生殖結構,但子囊及子囊孢子基本上不產生。