需要被蛋白酶體降解的蛋白質會先被連接上泛素作為標記，即蛋白質上的壹個賴氨酸與泛素之間形成***價連接。這壹過程是壹個三酶級聯反應，即需要有由三個酶催化的壹系列反應的發生，整個過程被稱為泛素化信號通路。在第壹步反應中，泛素活化酶（又被稱為E1）水解ATP並將壹個泛素分子腺苷酸化。接著，泛素被轉移到E1的活性中心的半胱氨酸殘基上，並伴隨著第二個泛素分子的腺苷酸化。 被腺苷酸化的泛素分子接著被轉移到第二個酶，泛素交聯酶（E2）的半胱氨酸殘基上。最後，高度保守的泛素連接酶（E3）家族中的壹員（根據底物蛋白質的不同而不同）識別特定的需要被泛素化的靶蛋白，並催化泛素分子從E2上轉移到靶蛋白上。靶蛋白在被蛋白酶體識別之前，必須被標記上至少四個泛素單體分子（以多泛素鏈的形式）。 因此，是E3使得這壹系統具有了底物特異性。 E1、E2和E3蛋白的數量依賴於生物體和細胞類型，人體中就存在大量不同的E3蛋白，這說明泛素-蛋白酶體系統可以作用於數量巨大的靶蛋白。
多泛素化後的蛋白質是如何被蛋白酶體所識別的，還沒有完全弄清。泛素受體蛋白的N末端具有壹個類泛素結構域，以及壹至多個泛素結合結構域。類泛素結構域可以被19S調節顆粒所識別，而泛素結合結構域可以通過形成三螺旋束來結合泛素。這些受體蛋白可能能夠結合多泛素化的蛋白質並將其攜帶到蛋白酶體，而關於這種結合的特異性和調控機制還不清楚。 但最近有研究者發現，調節顆粒上的亞基Rpn13可以發揮泛素受體的功能。
泛素蛋白自身由76個殘基所組成，以“泛素”為名是因為它在生物體中廣泛存在：具有高度保守的序列並且存在於所有已知的真核生物體中。真核生物中編碼泛素的基因以串聯重復（tandem repeat）的方式排列，這可能是因為大量轉錄的需要，為細胞生產足夠多的泛素。有人提出泛素是目前發現的進化速度最慢的蛋白質。 泛素化信號通路。其中，“Ub”表示泛素。
泛素化後的蛋白質（以下稱為底物蛋白）被19S調節顆粒所識別，這壹過程是壹個ATP依賴的結合過程。 然後，底物蛋白必須進入20S核心顆粒的內部孔道，以便與位於其中的水解活性位點接觸。由於20S顆粒的孔道相對狹窄，而且兩端由α環中亞基的N末端控制開關，所以底物蛋白在進入核心顆粒之前必須至少部分去折疊。將去折疊的蛋白質傳遞進入核心顆粒的過程被稱為“移位”（translocation），而移位必須發生在去泛素化之後。 但目前對於底物蛋白的去泛素化和去折疊機制還不了解。 在整個降解反應過程中，那壹步是限速步取決於底物蛋白的類別；對於壹些蛋白質，去折疊過程是限速步，而對於另壹些蛋白質，可能是去泛素化為限速因子。 至於哪些底物蛋白在移位之前必須去折疊，還未有結論，而牢固的三級結構和壹些特殊的非局部相互作用，如二硫鍵，能夠抑制降解。
由α亞基所形成的“門”可以阻止長於四個殘基的多肽進入20S顆粒的內部。在識別步驟開始前結合上的ATP分子在移位發生前被水解，而對於水解產生的能量是用於蛋白質去折疊 還是“門”的打開 還有爭議。26S蛋白酶體在存在無法水解的ATP類似物（即無法獲得水解產生的能量）的情況下，依然可以降解去折疊的蛋白質，但卻無法降解折疊的蛋白質；這壹結果說明ATP水解所產生的能量至少部分被用於蛋白質去折疊。 在19S帽子處於ATP結合狀態時，去折疊的底物蛋白可以由促進擴散作用，傳遞通過開啟的“門”。
球蛋白去折疊的機制是基本類似的，但在壹定程度上也取決於蛋白質的氨基酸序列。研究者發現含有較長的甘氨酸或丙氨酸序列可以抑制去折疊，從而降低蛋白酶體的降解效率；其結果是生成含有部分去折疊蛋白質的混合物，這可能是由於ATP水解和去折疊步驟之間的脫節所導致的。 自然界中的壹些蛋白質也有這樣的甘氨酸-丙氨酸重復序列存在，如蠶絲中的絲心蛋白（fibroin）；值得壹提的是，特定的人類皰疹病毒基因的表達產物也含有這樣的序列，通過抑制蛋白酶體的作用，阻止了抗原呈遞到主要組織相容性復合體上，從而有助於病毒的繁殖。
20S核心顆粒的壹個剖面圖，顯示了活性位點的位置。其中，α亞基用綠色的球來表示，β亞基的蛋白骨架顯示為飄帶，並且不同的多肽鏈用不同的顏色表示。小的粉色球表示每個亞基的活性位點中蘇氨酸殘基的位置。淡藍色的化學結構為結合在活性位點上的抑制劑硼替佐米（bortezomib）。 蛋白質的降解由20S核心顆粒中的β亞基進行，其機制被認為是蘇氨酸依賴的親核攻擊。這壹機制可能需要有壹個結合的水分子參與活性的蘇氨酸上羥基的去質子化。降解發生在核心顆粒中間的兩個β環內的孔道裏，壹般不生成部分降解的產物，而是將底物蛋白完全降解為長度壹定的肽段；肽段的長度壹般為7-9個殘基，但根據生物體和底物蛋白的不同，長度範圍可以從4-25個殘基不等。決定分解產物中肽段長度的機制，目前還沒有完全弄清。 雖然具有催化活性的三個β亞基具有***同的降解機制，但它們對於底物的特異性卻略有不同，分別為類胰凝乳蛋白酶型、類胰蛋白酶型和肽谷氨酰基肽水解型。這種對於底物特異性的差異是來自於靠近活性位點的局部殘基與底物之間的相互作用的不同。每壹個具有催化活性的β亞基也都含有壹個降解所必需的保守的賴氨酸。
雖然蛋白酶體通常生成非常短的降解片斷，但在壹些情況下，這些降解產物自身是具有生物學活性的功能分子。特定的轉錄因子，包括哺乳動物的NF-κB復合物中的壹個組分，合成後是以無活性的前體分子存在，在經過泛素化和蛋白酶降解後，才轉變為活性分子。這種降解需要蛋白酶體剪切蛋白質的中間部分，而不是通常情況下的從蛋白質的壹端開始的剪切。有人提出，需要被剪切的中間部分為壹個長的loop，位於蛋白表面，從而可以作為蛋白酶體的底物進入其內部孔道，而蛋白質的其他部分依然在孔道外，並不會被降解。 在酵母蛋白中也發現了類似的現象；這種選擇性降解被稱為“受調控的泛素-蛋白酶體依賴的剪切”（regulated ubiquitin/proteasome dependent processing）。 雖然大多數的蛋白酶體的底物必須在降解之前被泛素化，但仍然有壹些例外的情況，尤其是在蛋白酶體參與蛋白質的翻譯後處理過程中。壹個主要的例子是蛋白酶體通過將p105蛋白剪切為p50蛋白來激活NF-κB。 壹些由於存在無結構區域（參見intrinsically unstructured proteins）而被推測具有不穩定性的蛋白質也可以通過非泛素依賴的途徑被降解。鳥氨酸脫羧酶是最著名的非泛素依賴途徑中蛋白酶體的底物。 對於關鍵的細胞周期調控因子，如p53蛋白的非泛素依賴的降解機制已經有報道，雖然p53蛋白也可以通過泛素依賴的途徑被降解。 此外，在壹定的細胞應激條件下，結構不正常、錯誤折疊或者過度氧化的蛋白質也都會進入非泛素依賴的和非19S顆粒依賴的降解途徑。