材料及方法
1、DNA提取
1.1. 所需材料：
試劑盒：
ChargeSwitch? gDNA Rendered Meat Purification Kit (Product #CS400-100)
PowerClean? DNA Clean-Up Kit (Product# 12877-50)
BioGX Ruminant and Porcine Beads (Product # 204-0002)
設備要求:
Micro centrifuge
Heat Block
Nuclease Free Water
Vortex
Invitrogen Magna Rack
2.0 mL Tubes
Smart-Cycler
Smart Cycler centrifuge
Smart Cycler cooling block
SmartCycler 25 ?L reaction tubes
1.2. 操作步驟
a. 加入混勻的肝素鈉樣品到2ml離心管的0.5ml標記線。
*關鍵步驟：每次只加壹個樣，前壹個樣品加樣完成前不能打開下壹個離心管。
b. 加入1ml ChargeSwitch Lysis Buffer到樣品中。往離心管加入裂解緩沖液時，離心管稍微傾斜。
c. 每樣加入100μlChargeSwitch SDS。渦旋5s混勻。
d. 95℃孵育（水浴或加熱箱）5min。
e. 每樣加入400μl ChargeSwitchPrecipitation Buffer（N5）。渦旋5s混勻。
f. 冰浴離心管5min沈澱蛋白。
g. 室溫16100g離心5min。
h. 轉移1200μl上清液到壹個新的離心管中。
i. 渦旋裝有ChargeSwitch Magnetic Beads的離心管，充分重懸浸泡在儲存緩沖液中的磁珠。
j. 加入200μlChargeSwitch Detergent到含上清液的離心管中。
k. 加入40μl充分重懸的ChargeSwitch Magnetic Beads。
l. 上下吹打5次混勻。
m. 室溫孵育1min。
n. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沈澱，上清變清澈（約
1min）。
o. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沈澱。吸取上清時槍頭不要對著沈澱物。
p. 從磁鐵取下離心管。
q. 加入1ml ChargeSwitch Wash Buffer到離心管，上下吹打5次混勻。
r. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沈澱，上清變清澈（約
1min）。
s. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沈澱。吸取上清時槍頭不要對著沈澱物。
t. 從磁鐵取下離心管。
u. 加入750μl ChargeSwitchWash Buffer到離心管，上下吹打5次混勻。
v. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沈澱，上清變清澈（約
1min）。
w. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沈澱。吸取上清時槍頭不要對著沈澱物。
x. 加入750μl ChargeSwitchWash Buffer到離心管，上下吹打5次混勻。
y. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沈澱，上清變清澈（約
1min）。
z. 離心管留在磁鐵上，小心吸掉上清不攪渾沈澱。吸取上清時槍頭不要對著沈澱物。最後壹次
清洗，吸掉所有上清。
aa. 從磁鐵取下離心管，此時管內不應有上清液。
bb. 加入75μl ChargeSwitchElution Buffer（E5）到離心管。
cc. 輕輕上下吹打10次重懸ChargeSwitchMagnetic Beads。
dd. 室溫孵育1min。
ee. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沈澱，上清變清澈（約
1min）。
ff. 離心管留在磁鐵上，小心轉移含有DNA的上清到壹個新的滅菌了的2ml離心管中，勿攪動
沈澱。吸取上清時，槍頭不要對著沈澱。
gg. 棄去用過了的ChargeSwitch Magnetic Beads。
*DNA -20℃冷凍保存或繼續進行DNA純化去雜質
2. DNA純化去雜質
2.1. 操作步驟
a. 加入75μl nucleasefree水到DNA樣品中。
b. 加入750μl PowerCleanDNA Solution 1到DNA中。上下顛倒3-5次混勻。
c. 加入20μl PowerCleanDNA Solution 2，上下顛倒3-5次混勻。
註意：檢查PowerClean DNA Solution 2，若有沈澱，60℃水浴並輕搖直至沈澱全部溶解。不要劇烈搖晃以免產生大量泡沫。可趁熱使用。
d. 加入85μl PowerCleanDNA Solution 3，上下顛倒3-5次混勻。4℃孵育5min。
e. 室溫10000g離心1min。
f. 避開沈澱，轉移所有上清到壹個幹凈的2mlCollection Tube（試劑盒提供）中。
g. 加入70μl PowerCleanDNA Solution 4，上下顛倒3-5次混勻。4℃孵育5min。
h. 室溫10000g離心1min。
i. 避開沈澱，把上清轉移到壹個幹凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。
j. 搖勻PowerCleanDNA Solution 5。加入800μl PowerCleanDNA Isolation 5到上清中，渦旋5s
混勻。
k. 加載600μl上清液到Spin Filter中，室溫10000g離心1min。
l. 棄去濾液，把剩余的600μl上清都加到Spin Filter上，室溫10000g離心1min。
m. 棄去濾液。加入500μl PowerCleanDNA Solution 6到Spin Filer，室溫10000g離心30s。
n. 棄去濾膜。
o. 室溫13000g離心2min。
p. 小心把Spin Filter轉移到壹個新的2ml Collection tube（試劑盒提供）中。避免沾到任何PowerClean DNA Isolation 6。
q. 加入75μl PowerCleanDNA Solution 7到白色濾膜中心。
r. 室溫10000g離心30s。
s. 棄去Spin Filter。-20℃冷凍保存直至PCR擴增。
3. 實時熒光定量PCR擴增
設計該操作流程/步驟是為使用Cepheid的SmartCycler分析豬源肝素樣品中反芻動物DNA的存在。在其他操作平臺上使用該步驟需要適當的加以調整以驗證這部分是否符合（相對應平臺的）標準程序。
3.1. 準備實時檢測
a. 從冰箱中取出裝有樣品制備珠管的可重復用密封袋。從密封區域頂部的缺口
撕開袋子。
b. 從袋中取出所需數量的管子，並輕輕打開每壹根管子。
c. 向每管中加入25 ?L無核酸水（無核酸汙染的水），用槍頭混合後蓋上管蓋。
d. 使用微量離心機將所有管子快速離心5s。
e. 珠子空白對照（珠子+無DNA的水）必須與每壹批待測樣品同時檢測。
3.2. 步驟
a. 分裝25 ?L先前準備好的預混液（珠子和水）至SmartCycler PCR反應管。
b. 向每壹根對應的PCR反應管中加入1 ?L樣品。
c. 蓋上管蓋，在SmartCycler離心機中離心5s。
d. 將PCR反應管放入SmartCycler區塊的每壹孔中並蓋上各個蓋子。
e. 準備運行程序：
f. 點擊"CreateRun"圖標。染料設置選擇FCTC。
g. 選擇操作規程（見3.3部分）。
h. 選擇適當數量的位點（即在運行的PCR管的數量）
i. 給每壹個位點標註壹個與每管組分相對應的樣品ID。
j. 點擊"StartRun"。
註：陽性結果需要有壹個循環閾值（Ct值）。
3.3 PCR反應條件
這壹操作規程必須在PCR運行開始前加以設定。使用唯壹的名稱保存參數。
PCR程序：
第壹階段：95.0°C 120s（光學元件關閉）
第二階段：45個循環
95.0°C 10s（光學元件關閉）
56.0°C 60s（光學元件開啟）
註：分析時，Ct值應設定成缺省值30
4. 結果分析
染料設定為FCTC，用於熒光檢測。反芻動物DNA的陽性結果的判定是壹個樣品在FAM通道45個反應循環之前出現Ct值。豬的材料的陽性結果是在TxR通道出現陽性的Ct值。內部擴增控制（IAC）在Cy5通道中報告，有助於降低假陰性報告。許多不同類型肝素樣品含有抑制劑。本試驗包括壹個IAC，以確保PCR的條件是合適的，這樣，最大限度地減少由熱啟動酶的抑制造成的假陰性結果報告。具體地講，IAC可以反映樣品中存在PCR抑制因子時報道的陰性結果。引物與探針能結合反應混合物中合成的序列。
當樣品中沒有PCR抑制因子，而靶目標沒有擴增時，IAC應當產生Ct值為32-37之間的信號。如果目標樣品是高濃度，IAC可能會也可能不會報告由於競爭而出現的擴增。這是正常的。
如果IAC在Ct值37處仍未出現，或者在目的擴增中沒有報告（其Ct值），樣品可能含有阻止目的檢測的PCR抑制劑。如果觀察到這壹結果，建議將分裝的新的肝素粗品重提並額外純化後使用。
對於反芻動物樣品的陽性結果，應當用PCR對同壹DNA樣品額外檢測兩次，即全部三次檢測結果均為陽性的，則確認該樣品為陽性。