《新世紀福音戰士：Q》講述前作《破》最後階段所描述的“近第三次沖擊”14年之後的世界；全片幾乎以碇真嗣的視角呈現。
導演把整個劇情拆分五段來進行拍攝敘述——
1、US作戰
影片開始，葛城美裏領導部分前NERV成員組成反NERV組織“WILLE”，對NERV的EVA進行殲滅行動。WILLE所屬EVA改2號機（搭乘者：式波·明日香·蘭格雷）和8號機（搭乘者：真希波·瑪麗·伊蘭崔亞斯）在衛星軌道上對被NERV封印的初號機進行奪回作戰“US作戰”。
改2號機受到自動防衛系統“Mk.04A”的攻擊，在8號機的援護射撃下進行突破。接著遭到與初號機收容在壹起的“Mk.04B”的阻擊而面臨墜入大氣層燒毀的危險，明日香向真希波求救，暫時覺醒的初號機將Mk.04B消滅，2號機和初號機壹同返回地球。作戰成功。
2、AAA Wunder
在WILLE的戰艦“AAA Wunder”上醒來的真嗣，於14年之後重遇葛城美裏和明日香等WILLE成員。眾人認為真嗣是引起“近第三次沖擊”的元兇而冷待他；並警告他不得再駕駛EVA，更強行要他佩戴能致死的項圈“DSS Choker”，以免他駕駛EVA時因自身感情引發EVA覺醒而失控。眾人又告訴真嗣14年前綾波麗並未獲救。
Wunder遭“涅墨西斯系列”4機的襲擊，擁有“弒神之力”的Wunder炮擊並消滅對方。之後NERV所屬的EVA Mark.09前來襲擊Wunder，真嗣誤認Mark.09為零號機，並聽出駕駛員為綾波麗的聲音，隨後無視葛城美裏的警告而同Mark.09壹道前往NERV。8號機出擊阻截Mark.09失敗，但葛城美裏始終沒有啟動“DSS Choker”。
3、NERV總部
地表之上的第3新東京市早已消失，回到被摧毀的NERV總部的真嗣，接到碇源堂命令，要與渚薰壹起駕駛EVA第13號機。
真嗣在得知綾波麗依然活著，並在鋼琴二重奏中與渚薰熟稔後逐漸重新振作。但真嗣稍後得知自己在14年前引發“近第三次沖擊”，導致地球生命滅絕，而綾波麗只是自己母親的克隆人，自己並未救出當年認識的綾波麗，因而再度感到絕望。
第13號機完成後，真嗣拒絕行動。渚薰為真嗣拆除DSS項圈，把它戴到自己的脖子上並說“當第13號機手持朗基努斯與卡西烏斯兩把槍，就能讓世界重新來過”，成功說服真嗣壹同駕駛第13號機。
4、中央大垂直溝最深處
第13號機同綾波麗駕駛的Mark.09壹起抵達了中央大垂直溝最深處，薰看到Lilith和EVA Mark.06分別被長槍貫穿並醒悟NERV背後目的。此時明日香的改2號機和真希波的8號機來襲，薰無暇解釋而只能勸阻真嗣拔出槍，但壹心希望重獲眾人認同的真嗣強行切斷薰對EVA的控制權並拔出了兩把槍。
之後，第2使徒Lilith的屍骸崩解，潛藏在Mark.06體內的第12使徒再度活動，並在Mark.09將Mark.06的頭斬落時，以黑色帶狀形態纏繞第13號機。結果第13號機覺醒，使全身布滿核心的第12使徒迅速縮小並將之吞噬。之後第13號機超越疑似神化形態並飛上空中。
5、第四次沖擊
真嗣驚愕地目睹第四次沖擊開始並再次摧毀地表。葛城美裏率領Wunder攻擊第13號機以制止沖擊；但碇源堂命復制綾波麗利用Wunder原主人Mark.09（Adams的容器）趁機搶奪Wunder控制權。明日香透過“代號777”將改2號機獸化與Mark.09交戰，並把Mark.09的頭擰斷；
雙方駕駛員強行射出插入栓，改2號機最終自爆將Mark.09殲滅。在第13號機內，薰安慰自責的真嗣，並在DSS項圈爆炸前用兩枝槍刺穿第13號機的核心，但沖擊仍然繼續，直至真希波強行拔出真嗣的插入栓才告停止。
真希波和8號機隨同“AAA Wunder”離開。逃出的2號機改明日香在地上廢墟找到真嗣的插入栓，發現他再度失去鬥誌，只得把他拽出艙外。此時，從Mark.09逃出的復制綾波麗出現，於是三人壹起走向遠方等待救援，《新世紀福音戰士：Q》的劇情完結。