RACE技術的原理和操作方法？

樓主妳好：RACE技術的原理和操作 近年來隨著生物技術的不斷發展，出現了許多克隆新基因的方法和手段，如圖譜克隆技術、轉座子標簽技術、mRNA差異顯示技術二基因組減法技術以及cDNA文庫篩選技術等。但上述方法人多具有實驗周期長、技術步驟煩瑣且工作量大等特點。cDNA末端快速擴增技術（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是壹種基於PCR從低豐度的轉錄本中快速擴增cDNA的5＇和3＇末端的有效方法，以其簡單、快速、廉價等優勢而受到越來越多的重視。經典的RACE技術是由Frohman等（1988）發明的壹項技術，主要通過RT-PCR技術由已知部分cDNA序列來得到完整的cDNA5＇和3＇端，包括單邊PCR和錨定PCR。該技術提出以來經過不斷發展和完善，克服了早期技術步驟多、時間長、特異性差的缺點（Frohman等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等11999）。對傳統RACE技術的改進主要是引物設計及RT-PCR技術的改進：改進之壹是利用鎖定引物（（lock docking primer）合成第壹鏈cDNA，即在oligo（dT）引物的3＇ 端引入兩個簡並的核苷酸5＇-Oligo（dT）16-30MN-3＇，M=A/G/C；N=A/G/C/T，使引物定位在poly（A）尾的起始點，從而消除了在合成第壹條cDNA鏈時oligo（dT）與poly（A）尾的任何部位的結合所帶來的影響；改進之二是在5＇ 端加尾時，采用poly（C），而不是poly（A）；改進之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。病毒（MMLV）反轉錄酶或選擇嗜熱DNA聚合酶可能在高溫（60℃ -70℃）有效地逆轉錄mRNA，從而消除了5＇端由於高CC含量導致的mRNA 二級結構對逆轉錄的影響；改進之四是采用熱啟動PCR （hot start PCR）技術和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反應的特異性。更多質量檢測、分析測試、化學計量、標準物質相關技術資料請參考國家標準物質建材標準物質 /plist_1/plist_1_28_0_1.html隨著RACE技術日益完善，目前己有商業化RACE技術產品推出，如CLONTECH的MarathoTM技術和SMARTTM RACE技術。邢桂春等（2001）先後使用上述兩種試劑盒進行RACE反應，結果發現使用MarathonTM所得到的片斷總是比采用SMARTTM RACE試劑盒到所得到的片斷短。其原因在於MarathonTM技術反轉錄反應往往不能真正達到mRNA的5＇ 末端。所以認為，進行RACE反應應當優選SMARTTM RACE試劑盒。以下就國內目前應用最廣的SMARTTM RACE試劑盒為例，簡要概述RACE技術的原理和操作過程。SMARTTM 3＇-RACE的原理利用mRNA的3＇末端的poly（A）尾巴作為壹個引物結合位點，以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物反轉錄合成標準第壹鏈cDNA.然後用壹個基因特異引物GSP1（gene specific primer，GSP）作為上遊引物，用壹個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為下遊引物，以cDNA第壹鏈為模板，進行PCR循環，把目的基因3＇ 末端的DNA片段擴增出來。