第壹場：皇宮內有寶座的謁見室。舞臺是倫敦白金漢宮內女王的大廳，這時即將舉行慶典，用以表揚在蘇格蘭戰役中獲勝的雷瑟斯特伯爵率軍凱旋。出席慶典的貴族們，為雷瑟斯特伯爵和士兵們祝福，但只有伯爵的朋友諾佛克公爵面露不悅之色。原來，他是在嫉妒即將接受女王表彰的朋友。同時，女王又自言自語般唱出：“能和我所愛的人再見的日子又來臨”，成為女人的愛之歌。女王把勛章頒給雷瑟斯特後，接受了當作人質的蘇格蘭人，對他們微笑著答應給予寬宥。這段時間內，雷瑟斯特在人質中發現自己的妻子瑪蒂德和內弟恩利珂而大感驚訝。他在女王面前不曾提起自己已經結婚。
女王和眾人都退場後，舞臺上只剩雷瑟斯特和瑪蒂德，於是進入夫妻兩人的二重唱：“妳怎麽來到這裏?”“由於掛慮妳，才喬裝著跟來。”盡管女王允諾寬待他們，但畢竟還是人質。對妻子跟來這危險之地，雷瑟斯特還是非常生氣。雷瑟斯特自言自語說，如果被女王曉得自己娶了她的對敵瑪麗亞·史特亞達的女兒為妻，後果不堪設想，於是把瑪蒂德交托給內弟恩利科後先離去。這時瑪蒂德就悲傷地唱出詠嘆調《我聽到內部的聲音》（sento un’interna voce ）。
第二場：皇宮內的壹室。無比困惑與擔心的雷瑟斯特，向好友諾佛克透露自己已結婚的經過，並說出妻子瑪蒂德，其實就是蘇格蘭女王瑪麗亞·史特亞達的公主，然後請求他千萬不能讓英國皇室得悉。未料諾佛克卻背叛好友的信賴，對剛好出現的女王將這事實壹五壹十全都報告了，說完便離去。
女王因情人的背叛，由悲傷逐漸轉變成憤怒，命令古烈摩把雷瑟斯特伯爵、貴族們和蘇格蘭人質全部叫到大廳來，從左右兩側登場的雷瑟斯特和瑪蒂德，不曉得發生何事而困惑。女王壹眼便辨認出瑪蒂德是雷瑟斯特的妻子，於是故意拿起皇冠讓雷瑟斯特觀看，然後當眾宣布決定把皇位禮讓給他，當自己的夫婿。困惑不已的雷瑟斯特隨即意識到東窗事發，表示臣下不敢高攀這皇位。 第壹場：皇宮中的壹室。伊麗莎白命令古烈摩把瑪蒂德帶進這房間。女王說：“只要妳放棄壹切和雷瑟斯特的愛與權利，我願意饒妳壹命。”然後威脅說：“若是不肯，那麽死刑臺便等待著妳。”起初瑪蒂德說，這種事她絕對不會答應。可是壹想到丈夫和弟弟的安危，她就流著眼淚走到桌子邊，照女王的命令在同意和雷瑟斯特訣別的誓約書上簽名。這時雷瑟斯特也被帶到這房間，女王把瑪蒂德簽字的文件拿給他看而且表示：“她是妳的救命恩人！”未料雷瑟斯特卻憤怒地說：“我不願意拿她作為抵償來換取自己的生命！”說罷就將文件撕成碎片，同時又向女王吼叫：“我們的愛終生不渝！”這段是在女高音的二重唱中加入男高音的，於是形成三重唱。女王勃然大怒，命令衛兵把這兩人再關進牢裏。這時古烈摩登場，稟告女王諾佛克求見。但女王認為背叛友情的男人，不容許在皇宮內，而且他也是悲劇的禍首，於是命令把他驅逐。
第二場：監獄內的接待室。人們對雷瑟斯特伯爵表示同情。這時諾佛克悄悄來到，對自己背叛友情、激怒女王的事深感懊悔，高喊說要把雷瑟斯特救出，於是唱出詠嘆調《為受侮辱復仇》。
第三場：地牢中。雷瑟斯特獨自在地牢中，哀嘆著自己的命運，而且思念著愛妻：“因瞎眼的命運……可愛的妻子呵”（della cieta fortuna…sposa amata）。諾佛克出現，煽動雷瑟斯特說：“民眾站在妳這邊，請妳當民眾的領袖發動叛亂吧！”然後命令帶來的工兵，要他們把雷瑟斯特和瑪蒂德間的監牢墻壁破壞。這時，女王在衛兵引導下從臺階走下來，諾佛克驚慌地躲起來。女王告訴雷瑟斯特說：“議會判定妳死刑，我也在判決書上簽名，但我個人卻希望妳從壹條秘密通道逃走。”女王又說出，他和瑪蒂德的婚事，是諾佛克密告的。雷瑟斯特得悉是好友出賣時怒不可遏，於是告訴女王：“諾佛克剛剛到這裏來過，勸我和女王作對，帶領暴動。”當女王表示壞人必須逮捕嚴辦時，諾佛克拔劍從隱蔽處沖出來，想暗殺女王。這時擊毀墻壁後目睹這緊急情況的瑪蒂德和恩利科立即飛奔而出，撲向諾佛克，奪下他的武器，而雷瑟斯特則挺身保護女王。女王命令部下把諾佛克逮捕，赦免了雷瑟斯特、瑪蒂德和恩利科三人，唱出詠嘆調《有高貴優美心靈的人們啊》（bell’alme gene rose）。
這時民眾蜂擁而入，向女王懇求饒恕雷瑟斯特伯爵。女王當著他們宣布說：“我已經寬恕了雷瑟斯特，我決定把妳們的將軍還給妳們。”同時表示要放棄自己的戀情，全心全力做好女王的義務，坐回寶座時唱出最後的跑馬歌（cavaletta）《愛情啊，從這顆心逃遁吧！”》（fuggi amor da questo seno）。最後在眾人齊聲歌頌女王慈悲與榮耀的合唱聲中幕落。