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試述堿裂解法提取質粒的基本原理及關鍵試劑的作用

試述堿裂解法提取質粒的基本原理及關鍵試劑的作用如下:

將細菌懸浮液暴露於高pH值的強陰離子洗滌劑中,會使細胞壁破裂,染色體DNA和蛋白質變性,將質粒DNA釋放到上清中。

盡管堿性溶劑使堿基配對完全破壞,閉環的質粒DNA雙鏈仍不會彼此分離,這因為它們在拓撲學上是相互纏繞的。只要用堿處理的強度和時間不要太過,當pH值恢復到中性時,DNA雙鏈就會再次形成。

在裂解過程中,細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物,後者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用K+取代Na+時,復合物會從溶液中有效地沈澱下來,離心除去變性劑後,就可以從上清中回收復性的質粒DNA。

在SDS存在的條件下,堿水解是壹項非常靈活的技術,它對E.coli的所有菌株都適用,並且其細菌培養物的體積可以從1-500mL以上。

更多內容如下:

在pH12.0~12.6堿性環境中,細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開,而***價閉環的質粒DNA雖變性但仍處於拓撲纏繞狀態。

將pH調至中性並有高鹽存在及低溫的條件下,大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質在去汙劑SDS的作用下形成沈澱,而質粒DNA仍然為可溶狀態。

通過離心,可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質,質粒DNA尚在上清中,然後用酚、氯仿抽提進壹步純化質粒DNA。

抽提質粒DNA常用堿裂解法,它是壹種應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法,其基本原理為:在堿性條件(pH12.5)下,線性染色體DNA的雙螺旋結構解開而變性,質粒DNA的氫鍵雖然斷裂,但兩條互補鏈彼此纏繞,緊密結合在壹起。