根據限制酶的結構，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第壹型（Type I）、第二型（Type Ⅱ）及第三型（Type Ⅲ）。
第壹型限制酶
同時具有修飾（modification）及識別切割（restriction）的作用；另有識別（recognize)DNA上特定堿基序列的能力，通常其切割位（cleavage site）距離識別位（recognition site）可達數千個堿基之遠。例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶
只具有識別切割的作用，修飾作用由其他酶進行。所識別的位置多為短的回文序列（palindrome sequence）；所剪切的堿基序列通常即為所識別的序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類。例如：EcoRI、HindⅢ。
第三型限制酶
與第壹型限制酶類似，同時具有修飾及識別切割的作用。可識別短的不對稱序列，切割位與識別序列約距24-26個堿基對。例如：HinfⅢ。
擴展資料
限制性內切酶分類性質
根據酶的功能特性、大小及反應時所需的輔助因子，限制性內切酶可分為兩大類，即I類酶和Ⅱ酶。最早從大腸桿菌中發現的EcoK、EcoB就屬於I類酶。其分子量較大；反應過程中除需Mg2+外，還需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上沒有特異性的酶解片斷，這是I、Ⅱ類酶之間最明顯的差異。
因此，I類酶作為DNA的分析工具價值不大。Ⅱ類酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。其分子量小於105道爾頓；反應只需Mg2+；最重要的是在所識別的特定堿基順序上有特異性的切點，因而DNA分子經過Ⅱ類酶作用後，可產生特異性的酶解片斷，這些片斷可用凝膠電泳法進行分離、鑒別。
限制性內切酶識別DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位點在回文的壹側（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另壹些Ⅱ類酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位點在回文序列中間，形成平整末端。
百度百科-限制性核酸內切酶