cdna是指互補DNA。
cdna簡介:
為具有與某mRNA(信使RNA)鏈呈互補的堿基序列的單鏈DNA即complementary DNA之縮寫,或此DNA鏈與具有與之互補的堿基序列的DNA鏈所形成的DNA雙鏈。與RNA鏈互補的單鏈DNA,以其RNA為模板,在適當引物的存在下,由依賴RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)的作用而合成。
並且在合成單鏈cDNA後,在用堿處理除去與其對應的RNA以後,以單鏈cDNA為模板,由依賴DNA的DNA聚合酶或依賴RNA的DNA聚合酶的作用合成雙鏈cDNA。
cdna重組:
①借助於末端轉移酶的3’—OH端合成均聚物的能力,雙鏈cDNA和線性化載體DNA的3’—OH端分別加上均聚核苷酸鏈。
②雙鏈cDNA和線性化載體DNA分別用Klenow片段進行末端補平,然後用T4 DNA連接酶進行齊頭連接,形成重組體。
③通過粘性末端連接。
轉化:
重組的載體DNA分子在壹定條件下轉化入大腸桿菌,形成攜帶質粒的菌株。當不同重組的DNA含有不同的cDNA基因時,整個轉化子含有來自mRNA群體的各種cDNA基因,這樣的轉化子群體構成該mRNA全部遺傳信息的cDNA基因文庫。
cdna雙鏈合成:
cDNA第壹鏈的合成:
用親和層析法得到mRNA後,根據mRNA分子的3’端有poly(A)尾結構的原理,用12—20個核苷酸長的oligo(dT)與純化的mRNA混合,oligo(dT)會與poly(A)結合作為反轉錄酶的引物,反轉錄反應的產物是壹條RNA—DNA的雜交鏈。
Oligo(dT)結合在mRNA的3’端,因此合成全長的cDNA需要反轉錄酶從mRNA分子的壹端移動到另壹端,有時這種全合成難以達到,尤其是mRNA鏈很長時,為此建立了壹種隨機引物法合成cDNA。
cDNA第二鏈的合成:
利用cDNA第壹鏈的3’末端常常出現發夾環的特征,這種發夾結構是反轉錄酶在第壹鏈末端“返折”並且進行復制第壹鏈的結果,它為合成cDNA第二鏈提供了有用的引物。用這種方法合成的雙鏈cDNA在壹端有壹個發夾環,可以用單鏈特異的S1核酸酶切去。
但是S1核酸酶的處理,常常會“修剪”過多的cDNA順序,使cDNA丟失了mRNA 5’端的部分順序。