壹、抗壞血酸含量測定
原理
還原型抗壞血酸(AsA)可以把鐵離子還原成亞鐵離子，亞鐵離子與紅菲咯啉(4，7－二苯基－1，10－菲咯啉，BP)反應形成紅色螯合物。在534nM波長的吸收值與AsA含量正相關，故可用比色法測定。脫氧抗壞血酸(DAsA)可由二硫蘇糖醇(DTT)還原成AsA。測定AsA總量，從中減去還原型AsA，即為DAsA含量。
儀器與用具
離心機；分光光度計；研缽；試管。
試劑
5％三氯乙酸(TCA)；
20％TCA；
無水乙醇溶液；
0?4％磷酸—乙醇溶液；
0?5％BP—乙醇溶液；
0?03％FeCl3—乙醇溶液；
0?6g／L DTT；
NA2HPO4—NAOH溶液：以0?2Mol／L NA2HPO4和1?2Mol／L NAOH等量混合；
60MMol／L DTT—乙醇。
方法
1.制作標準曲線配制濃度為2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L，12mg/L，14Mg／L的AsA系列標準液。取各濃度標準液1?0Ml於試管中，加入1?0Ml 5％TCA、1.0ml乙醇搖勻,再依次加入0?5Ml 0?4%H3PO4—乙醇、1?0Ml 0?5％BP—乙醇、0?5Ml 0?03%FeCl3—乙醇，總體積5?0Ml。將溶液置於30℃下反應90Min，然後測定A534。以AsA濃度為橫坐標，以A534為縱坐標繪制標準曲線，求出線性方程。
2.提取取植物葉片1?0g，按1∶5(W／V)加入5%TCA研磨，4000r／Min離心10Min，上清液供測定。
3.測定
(1)AsA測定取1.0Ml樣品提取液於試管中，按上述相同的方法進行測定，並根據標準曲線計算AsA含量。
(2)DAsA測定向1.0Ml樣品液中加入0?5Ml 60MMol／L DTT—乙醇溶液，用NA2HPO4—NAOH混合液，將溶液PH調至7～8,置於室溫下10Min，使DAsA還原。然後加入0?5Ml 20％TCA，把PH調至1～2。按AsA相同方法進行測定，計算出總AsA含量，從中減去AsA,即得DAsA含量。
二、抗壞血酸過氧化物酶(AsA－POD)活性
原理
AsA－POD催化AsA與H2O2反應，使AsA氧化成單脫氫抗壞血酸(MDAsA)。隨著AsA被氧化，溶液中290nM波長下的消光值(A290)下降，根據單位時間內A290減少值，計算AsA－POD活性。AsA氧化量按消光系數2?8(MMol／L)／CM計算，酶活性可用每克鮮重每小時氧化AsA的微摩爾數μMol／g·H表示。
儀器
離心機；紫外分光光度計；研缽；試管。
試劑
50MMol／L K2PO4—KH2PO4緩沖液(PH7?0，內含0?1MMol／L EDTA－NA2)?
0?3MMol／L AsA；
20μMol／L AsA；
0?06MMol／L H2O2。
方法
1?酶液制備取1?0g植物葉片剪碎，按1∶3(W／V)加入預冷的50MMol／L K2HPO4—KH2PO4緩沖液進行研磨提取，用兩層紗布過濾，濾液在4000r／Min下離心10Min，上清液作酶粗提液供測定。
2.酶活性測定3Ml反應混合液中含50MMol／L K2HPO4—KH2PO4緩沖液(PH7?0)，0.1MMol／L EDTA－NA2，0.3MMol／L AsA，0?06MMol／L H2O2和0.1Ml酶液。加入H2O2後立即在20℃下測定10～30s內的A290變化，計算單位時間內AsA減少量及酶活性。
思考題
1.抗壞血酸在植物體內有何生理意義?
2.簡述抗壞血酸過氧化物酶活性的測定原理。