兩者的區別：限制性內切酶的主要功能是保護細菌不受噬菌體的感染，而外切酶其水解的最終產物是單個的核苷酸（DNA為dNMP，RNA為NMP）。
核酸內切酶（endonuclease）：在核酸水解酶中，為可水解分子鏈內部磷酸二酯鍵生成寡核苷酸的酶，與核酸外切酶相對應。
外切酶：即核酸外切酶（exonuclease ）核酸外切酶是壹類能從多核苷酸鏈的壹端開始按序催化水解3、5-磷酸二酯鍵，降解核苷酸的酶。
：30多年前，當人們在對噬菌體（細菌病毒）的宿主特異性的限制-修飾現象進行研究時，首次發現了限制性內切酶。細菌可以抵禦新病毒的入侵，而這種"限制"病毒生存的辦法則可歸功於細胞內部可摧毀外源DNA的限制性內切酶。首批被發現的限制性內切酶包括來源於大腸桿菌的EcoR I和EcoR II，以及來源於Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。這些酶可在特定位點切開DNA，將基因切割成小的基因片段。
限制性酶主要分為三種類型：Ⅰ型限制酶為復合功能酶，具有限制-修飾兩種功能，但在 DNA鏈上沒有固定的切割位點，壹般在離切割位點1kb到幾kb的地方隨機切割，不產生特異性片段。Ⅲ型酶與Ⅰ型酶基本相似，不同的是Ⅲ型酶有特異性的切割位點，但這兩類酶對 DNA酶切分析的意義不大，通常所說的限制性內切酶是指Ⅱ型酶，它能夠識別與切割DNA鏈上的特定的核苷酸順序，產生特異性的DNA片段。
當限制性內切酶的應用在上世紀七十年代流傳開來的時候，以NEB為代表的許多公司開始尋找更多的限制性內切酶。除了某些病毒以外，限制性內切酶只在原核生物中被發現。人們正在從數以千計的細菌及古細菌中尋找新的限制性內切酶。而對已測序的原核基因組數據分析表明，限制性內切酶在原核生物中普遍存在，所有自由生存的細菌和古細菌似乎都能編碼限制性內切酶。
單鏈的核酸外切酶包括大腸桿菌核酸外切酶Ⅰ（exoⅠ）和核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）。核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）能夠從5′-末端或3′-末端呈單鏈狀態的DNA分子上降解DNA，產生出寡核苷酸短片段，而且是唯壹不需要Mg2+離子的活性酶，是壹種耐受性很強的核酸酶。核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）可以用來測定基因組DNA中壹些特殊的間隔序列和編碼序列的位置。它只切割末端有單鏈突出的DNA分子， 實際操作時需要配合解旋酶操作。
雙鏈的核酸外切酶包括大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）、λ噬菌體核酸外切酶（λexo）以及T7噬菌體基因6核酸外切酶等。大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ）具有多種催化功能，可以降解雙鏈DNA分子中的許多類型的磷酸二酯鍵。其中主要的催化活性是催化雙鏈DNA按3′→5′的方向從3′-OH末端釋放5′-單核苷酸。大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）通過其3′→5′外切酶活性使雙鏈DNA分子產生出單鏈區，經過這種修飾的DNA再配合使用Klenow酶，同時加進帶放射性同位素的核苷酸，便可以制備特異性的放射性探針。
限制性核酸內切酶分析技術是病原變異、毒株鑒別、分型及了解基因結構和進行流行病學研究的有效方法，對動物檢疫有很重要的實用意義，尤其對區別進出境動物及動物產品攜帶病毒是疫苗毒還是野毒，以及推論其是本地毒還是外來毒有很重要的意義。