簡並引物是指用來編碼壹段短肽序列的不同堿基序列的混合物。主要用來同源克隆未知的基因,或用來分析某壹種基因多態性的壹種方法。簡並引物設計的常見程序如下:1. 利用NCBI搜索不同物種中同壹目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列。
因為密碼子的關系,不同的核酸序列可能表達的氨基酸序列是相同的,所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統,查找到壹條相關序列即可。隨後利用這壹序列使用BLASTp(通過蛋白查蛋白),在整個Nr數據庫中中查找與之相似的氨基酸序列。
2. 對所找到的序列進行多序列比對。
將搜索到的同壹基因的不同氨基酸序列進行多序列比對,最好采用局部比對程序如BLOCK,網址:/thread-8194-1-1.html。
5. 對引物的修飾
若得到的引物為:5-NAGSGNGCDTTANCABK-3,則其簡並度=4×2×4×3×4×3×2=2304,很明顯該條引物的簡並度太高不利於 pcr。我們可以通過用次黃嘌呤代替N(因為次黃嘌呤能很好的和4種堿基配對)和根據物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡並度(有個查密碼子偏好的數據庫網址:/viewthrea ... ht=%C3%DC%C2%EB%D7% D3)。
註意:該方法設計出來簡並引物對,適用於用於比對的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。
引物中符號說明:
A代表A
C 代表C
G代表 G
T 代表T
M 代表A or C
R 代表A or G
W代表 A or T
S代表 C or G
Y代表 C or T
K代表 G or T
V 代表A or C or G
H 代表A or C or T
D代表 A or G or T
B 代表C or G or T
N代表 G or A or T or C