提質粒步驟如下:
壹、步驟
1、接1%含質粒的大腸桿菌細胞於2mlLB培養基。
2、37℃振蕩培養過夜。
3、取1.5ml菌體於Ep管(離心管),以4000rpm離心3min,棄上清液。
4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/LEDTApH8.0,25mM/LTris-HClpH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2mM/LNaOH,1%SDS),輕輕翻轉混勻,置於冰浴5min.
6、加入0.15ml預冷溶液III(5mol/LKAc,pH4.8),輕輕翻轉混勻,置於冰浴5min.
7、以10,000rpm離心20min,取上清液於另壹新Ep管
8、加入等體積的異丙醇,混勻後靜置10min.
9、以10,000rpm離心20min,棄上清。
10、用70%乙醇0.5ml洗滌壹次,抽幹所有液體。
11、待沈澱幹燥後,溶於50ulTE緩沖液中(或60℃溫育去離子水)。
二、實驗原理
提取質粒DNA的方法有很多種,從提取產量上分可分為微量提取、中量提取、大量提取,從使用儀器上分可分為壹般提取和試劑盒方法提取,從具體操作方法分可以分為堿裂解法、煮沸法、牙簽法等,各種不同的方法各有其優缺點,根據不同的實驗目的可以采用合適的提取方法。參考《分子克隆實驗指南》。
三、提取竅門
1、加溶液II(裂解液)後,操作壹定要溫和,劇烈混合會導致基因組DNA汙染。
2、洗脫時60℃溫育(Ellution-Buffer)洗脫緩沖液或去離子水效果更好。
3、若質粒提取含量低,可增加菌液樣或換用ArtMedia-Plasmid-Culture,其比LB培養基質粒得量高。
4、菌體應徹底懸浮,如果沒有徹底懸浮菌體,則殘留的菌體團塊在溶液II加入後,變成難以完全裂解的團塊。這個團塊在溶液III加入後,會有壹部分蛋白質繼續存在於溶液中,成為蛋白質殘留的最大根源。
5、加入溶液II後,混勻,體系最好能立即變得清澈。體系如果變得清澈了,馬上加入溶液III中和。
6、中和的操作,在1.5ml離心管中加入溶液III後,先顛倒兩次,使管底朝上,用指頭彈擊管底數次,再顛倒混勻。效果非常好。