我有個WB條帶分析軟件簡介，或許對妳有幫助。
凝膠定量軟件Quantity?One使用簡介
1?內容簡介
凝膠電泳是每個做分子生物學的同學天天都要打交道的基本技術。電泳之後的信息處理與電泳本身同樣重要。目前有大量軟件可以用於分析電泳結果，比較有名的比如BandScan、BandLeader、Sigma?Gel等等。今天要向大家介紹的是來自Bio-Rad的1D凝膠定量軟件Quantity?One（Bio-Rad還有壹個做2D凝膠分析的軟件PDQuest）。
2?Quantity?One的定量方法
Quantity?One的分析功能顧名思義主要用來進行凝膠或者培養皿的熒光定量分析。它的分析功能或者說分析方式主要有4種：泳道/條帶軌跡定量法；等高線直接定量法；菌落計數；分子量測定
這三種方法中使用最為方便也是最為廣泛的應該是等高線定量法（Volumn?Contour）。它通過半自動描繪電泳條帶的等高線邊緣來得到等高線區域內部面積，再將該面積乘以區域內平均光密度值得到條帶內部總的信號量。當然這種分析方法的弊病顯而易見：無法同等得排除不同泳道的背景亮度；等高線的繪制處於“半自動”狀態，即需要人為判斷作為等高線標準的電泳條帶的邊緣；最致命的是在幾個電泳條帶距離十分接近的時候幾乎無法繪制單壹條帶的輪廓（常出現連續的幾個條帶等高線相連而無法分離出單獨條帶的輪廓）。
三種方法中個人感覺最為科學和嚴謹的應該是泳道/條帶軌跡定量法（Trace?Tracking）。這種方法使用起來步驟較為繁瑣，必須通過泳道識別---電泳條帶識別兩個連續的步驟才能進行定量。然而這種方式的最大優點在於它可以完全拋棄人為主觀因素進行全自動定量。他的定量方式為：首先根據不同電泳條帶的光密度值繪制光密度曲線，然後計算光密度曲線下面積作為電泳條帶的定量根據。大家可能會問他能不能排除泳道背景？答案是肯定的，它能夠最大程度的排除不同泳道之間的背景差異，讓各個泳道上的不同電泳條帶在壹條幾乎相同的起跑線上進行對比。這個背景排除功能是等高線法無法做到的（等高線法也有基本的背景排除辦法，但是和泳道/條帶軌跡定量法的背景排除不是壹個等級的。等高線法只能排除同壹泳道上的背景，而不能均等的排除不同泳道的背景）。另外泳道/條帶軌跡定量法還可以結合Gauss?Model?Bands對緊密相連的電泳條帶進行分析，而這種條帶也是等高線法無法分析的。我們此次重點學習這個方法。
第三個分析功能是菌落計數（Colony?Counting）。這個功能其實很實用，可以分析藍白篩選的結果。但是很奇怪我的電腦居然無法運行這個功能，?因此無法向大家介紹了。
另外Quantity?One還可以通過回歸曲線測定
3?Quantity?One的基本常用菜單操作
下面讓我們了解壹下Quantity?One常用的基本菜單操作。
打開文件：由於Quantity?One是Bio-Rad的硬件配套軟件，因此Quantity?One可以自動輸入來自Bio-Rad公司的凝膠分析儀的數據。具體支持哪些硬件大家可以在“Edit-Preference-Imagers”裏面設置。如果您的實驗室沒有采用Bio-Rad的硬件設施也沒關系。您只要將電泳圖片用ACDSee等程序轉換為TIF圖片格式就可以被Quantity?One識別了。註意Quantity?One只支持8位和16位灰度的TIF文件。
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Quantity?One似乎有壹個小bug，就是在按“Open”之後並沒有立刻彈出資源管理器讓妳選擇目標文件的位置。其實妳只要將鼠標在屏幕右下方點擊壹下，資源管理器就會乖乖彈出來了.
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Quantity?One只能分析白色背景+黑色條帶的電泳圖。而我們正常情況下得到的壹般都是黑色背景+白色條帶的電泳圖。我們可以在“Image-Invert?data中將圖片色彩進行反轉，然後便可以用Quantity?One進行分析了.
文字註釋：Quantity?One提供基本的文字註釋功能。您可以在您的電泳圖片上記錄您的分析結果比如電泳條帶的分子量、光密度值、物質的量等等。這個功能可以通過“Edit-Text?Overlay?Tools”來實現。在彈出的浮動工具欄中選擇“ABC”或者“”就可以進行文字輸入和畫標記線的操作。
光密度工具：在“View-Plot?Density”的下級菜單中大家會見到幾個和電泳條帶光密度值相關的顯示選項。大家可以分別選擇不同的選項感受壹下它們之間的差別。選擇方法是點擊相應的下級菜單比如“Plot?Cross?Section”，然後將變成帶壹個藍色感嘆號的鼠標移到您想知道光密度的位置，點擊壹下就會顯示該處的光密度相關信息。在下面這幅圖片中我們可以看見兩條黃線交叉處的電泳條帶的相關信息。上方的壹串曲線是不同泳道之間在同壹水平線上的光密度比值曲線；左邊是黃線交叉處所在泳道的幾個電泳條帶的光密度分布情況。
3D?Viewer：在“View-3D?Viewer”菜單中大家會看到壹個有趣的功能叫做3D?Viewer。這個玩意按照Bio-Rad的說法可以輔助辨別幾條緊密相連在壹起的電泳條帶的分布情況。大家只要選擇了這個命令後鼠標就會壹個“+”型，然後將+型移動到您感興趣的位置，拖動鼠標畫出壹個正方形區域，然後用鼠標雙擊，Quantity?One就會將這塊區域按照gauss分布規律渲染成壹個三維模型，頗有意思。
4?Quantity?One的基本背景排除功能
最開始的時候我們就說過Quantity?One的等高線定量模式也有壹種比較基本的背景排除方法。這個方法同樣也適用於泳道/條帶定量模式。現在我們就來學習這個方法。基本背景排除的功能位於“Image-Substract?backgroud...”和“Image-Filter?Wizard...”這兩個菜單。
Image-Filter?Wizard：這個功能是對原始圖片做壹些初步的加工，主要是除去壹些圖片上的“斑點”。這些斑點主要有兩種類型：壹種是深色的“胡椒面”型和淺色的“食鹽”型，兩種斑點都可以毫不猶豫地去除。從“Image-Filter?Wizard...”菜單調出向導菜單後選擇“pepper”和“salt”，下面兩個選項可以按照程序默認的選項，然後“OK”就可以完成這第壹步的降噪過程。
Image-Substract?backgroud：這個功能是真正對圖片背景進行清理的工具（區別於“Image-Filter?Wizard...”的降噪模式）。只是這種清理是壹種“全局”型的清理，即它以相同的參數對每條泳道進行背景清理。然而在清理方式上它還是可以分成兩種不同的方式：
Backgroud?Box：壹種是以壹個局部小面積為標準背景，將整張電泳圖片上所有比該區域光密度值低的區域全部漂白。這種發式稱為“Backgroud?Box”。操作時用鼠標選中對話框下部左側的“Backgroud?Box”按鈕，然後用鼠標在電泳圖片上選擇壹塊色彩接近於背景色，色澤比較均勻的區域，用鼠標拖動畫出壹個正方形。釋放鼠標後程序就會立即對電泳圖片進行降低背景的處理；
Backgroud?Stripe：相對於“Backgroud?Box”來說是壹種更加智能化的處理方式。它特別適用於梯度凝膠，即凝膠濃度由上至下依次變化。由於梯度膠的光密度值在壹定距離內不斷變化，因此如果采用“Backgroud?Box”的方法除背景就會發生偏差。Quantity?One此時提供壹種隨著凝膠濃度變化而變化的除背景方式就是“Backgroud?Stripe”。和“Backgroud?Box”類似，選擇右下角的“Backgroud?Stripe”按鈕，然後用鼠標沿著電泳泳道拖放形成壹個狹長的剪影帶（Stripe），這個剪影帶內部的光密度值順著泳道逐漸升高或降低。Quantity?One根據這個Stripe可以動態的對整張圖片的背景進行剪影。比如泳道起始處光密度低，那麽Quantity?One在此處的剪影值也降低；隨著Stripe向前延伸，光密度值逐漸升高，Quantity?One也同樣不斷加大剪影的強度。這樣壹來就可以排除由於梯度膠帶來的背景不壹致的影響因素。
5?Quantity?One的電泳泳道分齬δ?--創建泳道
前面說過Quantity?One之所以強大是因為它具有的泳道/條帶軌跡定量法。現在我們就來學習壹下如何在電泳圖片上創建泳道（Lane）以及如何進行針對不同泳道的背景排除。
創建泳道：首先打開我們要分析的電泳圖片（以蛋白質電泳為例）。然後選擇“Lane-Auto?Frame?lanes”。這時如果您的電泳圖片比較標準的話，Quantity?One就會自動識別出每條電泳泳道的位置，而且將各個泳道的路徑用壹條紅線標畫出來；
如果您對軟件自動標記的泳道不甚滿意，您可以通過“Lane-Edit?Frame”下級各個子菜單提供的功能對泳道框架位置、大小等進行調節。調節方法就是通過鼠標的拖放來實現，大家可以自己體驗壹下；
如果您只需要分析其中幾個泳道的數據而不想其他泳道的標記幹擾您的視線，您可以通過“Lane-Single?Lane-Remove?Lane”刪除您不需要的泳道的標記。
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不是所有的電泳圖片的泳道都能夠被Quantity?One自動識別。在不能自動識別的情況下，Quantity?One就會彈出對話框告訴您它不能識別泳道。這時大家就需要手工繪制電泳泳道。方法和上面壹樣，同過“Lane-Single?Lane-Creat?Lane”來實現。只要用鼠標在您的電泳圖片上順著待標記的泳道的中軸線拖放就可以繪制出該泳道的標記紅線.
6?Quantity?One的電泳泳道分析功能---排除背景
前面說過Quantity?One之所以強大是因為它具有的泳道/條帶軌跡定量法。現在我們就來學習壹下如何在電泳圖片上創建泳道（Lane）以及如何進行針對不同泳道的背景排除。
排除背景：首先請大家註意，這個排除背景和前面我們在“Image”菜單中使用的“Substruct?Backgroud”有所不同。後者排除背景的對象是整個電泳圖片而非將各個電泳泳道的背景分別進行排除。現在我們要學習的這個命令可以幫助我們分別排除各個泳道（也可以將全部泳道用相同標準進行排除）的不同的光密度背景。這個功能對我們以後的分析影響甚大，大家壹定好好學習。
首先我們要將我們的電泳圖片進行前面談到的泳道識別，不管是自動方式還是手工識別。然後選擇“Lane-Lane?Backgroud...”命令。選擇該命令後，鼠標即變成壹個綠色的“+”，將鼠標移到您打算進行背景排除的泳道（比如下圖中的第4泳道），點擊左鍵壹下，立刻就會彈出如下圖所示的對話框。
其中“Optical?Density”顯示得是該泳道光密度值的分布情況。大家會註意到這個分布曲線並不是緊貼著縱軸，而是位於縱軸上方分布。造成這個“懸空現象”的原因就是該泳道自身存在著壹定的光密度“背景”。這個背景的存在導致該泳道上各個電泳條帶之間不能處於同壹水平進行對比；如果考慮到相鄰的其他泳道更是因為不同背景的存在而無法對比不同泳道上的不同電泳條帶。如何去除這個背景呢？我們繼續看右邊的“Lane?Backgroud?Substruction”對話框。這個對話框的上方“All?Lanes”表示可以對所有泳道進行壹次性處理；下方的“Selected?Lane”表示僅針對此次選中的這個泳道進行處理（我們選中的是第4泳道）。我們用鼠標選擇“Selected?Lane”的“Lane?On”選項。然後在下面的“Rolling?Disk?Size”裏填上“5”，再按“回車”鍵。好！大家再來看看現在“Optical?Density”中出現了壹條緊緊沿著光密度曲線分布的醬色曲線。這條曲線將泳道的背景與電泳條帶的光密度分布十分精確的劃分開來。
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大家可能會好奇這裏的“Rolling?Disk?Size”指得是什麽意思？我們可以將Quantity?One提供的去除背景功能想象成是壹個滾動的小球。如果這個小球的半徑越小，那麽它沿著光密度曲線滾動時滾過的路徑就越發精細，具體反映在醬色曲線的軌跡越發靠近黑色光密度分布曲線的基線。因此從理論上來說“Rolling?Disk?Size”的取值越小，它的去除背景效果越好。大家可以試著選擇壹個較大的值比如80，再來看看此時醬色曲線的軌跡。當然也不能取太小的值。因為如果取值太小，大家可以想象這個十分微小的球就會滾入光密度曲線內部，造成有效陽性信號的損失。個人感覺5~20是壹個比較好的取值範圍.
OK！我們再在“Lane?Backgroud?Substruction”對話框的最下方鉤選“Show?Lane?Trace?with?Backgroud?Substructed”，再來看看是不是泳道上所有的背景都被消除了？各個電泳條帶是不是完全結合到縱軸上在同壹水平進行比較了？
我們對於其他泳道也可以依葫蘆畫瓢進行類似的背景排除工作。如果大家覺得可以使用同樣的標準，即相同的“Rolling?Disk?Size”進行排除，那麽我們可以在“Lane?Backgroud?Substruction”對話框中選擇上方的“All?Lanes?On(same?level)”選項。然後在“Rolling?Disk?Size”中填上壹個合適的值，點擊“Done”按鈕確認就可以了。此時該電泳圖片上所有的泳道都以相同的標準進行了背景去除。不信妳可以自己將鼠標點擊其他泳道（比如第8道或第1道），妳會發現所有泳道的背景均已去除。
7?Quantity?One的電泳泳道分析功能---對比泳道
剛才我們已經對電泳圖片上的泳道進行了識別和背景去除。現在我們可以利用Quantity?One提供的泳道對比功能對同壹張凝膠照片上的不同泳道進行對比，看看每條泳道上電泳條帶的分布情況。
泳道對比：首先將打開的電泳照片進行前面談到的泳道識別和去除背景步驟。然後選擇“Lane-Compare?Lanes”命令，鼠標變成“藍色感嘆號”之後將鼠標移動到您希望進行對比的泳道上（比如下圖的第3泳道），左鍵點擊，Quantity?One就會立刻探出壹張黑色背景的“Compare?Lanes”對話框。在這個對話框中紅色的曲線代表您選擇的泳道的光密度分布曲線。曲線的波峰部分表示位於泳道上的不同電泳條帶；波峰的高低象征電泳條帶光密度值的大小；波峰的寬窄象征電泳條帶的寬度；波峰由左至右表示各個電泳條帶順著泳道由後向前的分布。
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大家請註意這個紅色曲線。它不僅僅提供給我們關於泳道上光密度的分布情況，更重要的是在下壹步我們對電泳條帶進行定量的時候，我們將以每個波峰的曲線下面積作為定量的標準.
我們還可以用鼠標點擊其他我們感興趣的泳道（比如下圖中第6、9、14泳道），這時再轉到“Compare?Lanes”對話框我們會發現Quantity?One已經幫我們用不同顏色在同壹張圖片上繪制出了這4條泳道的對比圖。是不是非常PP？
8?Quantity?One的電泳條帶分析功能---創建條帶
前面我們已經識別和分析了電泳圖片的泳道，下面我們開始研究電泳條帶的問題。首先在這裏明確兩個名詞翻譯：“Lane”指電泳泳道；“Band”指電泳條帶。在下文中壹律使用這兩個英文名詞來表示這兩個意思。
電泳條帶的識別：和前面研究Lane壹樣，首先我們要對Lane上的Band進行識別。識別方式同樣分為自動識別和人工識別。自動識別的時候選擇“Band-Detect?Bands...”命令。這時Quantity?One會自動彈出壹個“Detect?Bands”的對話框（如下圖）。
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第壹次用Quantity?One的朋友可能會發現您的Bands識別以後僅僅是畫出了壹條紅色的粗線，而在上面的演示圖片中卻是上下括號的形式。其實大家可以在“Band-Band?Attributes”選項中設置Bands的顯示形式。在下方的“Style”選項卡中選擇“Brackets”就會將原來的粗線改為括號形式了.
在上面的對話框中，我們可以指定識別的參數。
如果要自動識別所有Lanes上的Bands就鉤選Lands後面的“All”選項；如果僅僅想自動識別某壹條Lane上的Bands就鉤選“One”，然後在後面的輸入框中填上您想識別的泳道號碼；
如果僅僅想識別泳道上部分光密度值最強的Bands，可以在“Bands”後面的選項中選擇“Limit”，然後填上相應的數目（比如10）。Quantity?One就會僅識別該泳道上光密度最大的10條Bands；
如果您發現自動識別的Bands寬度太窄，圈定Band的紅色括號內範圍小於黑色的光密度影。此時可以使用“Lane?Width”命令來調整Bands識別的寬度。用鼠標點擊“Lane?Width”後面的向上箭頭就會發現紅色括號逐漸變寬，最後要求其範圍略為寬過其包繞的Band影跡；
如果您發現自動識別功能沒有識別您想要的Band或者誤識別了您不想要的Band，您還可以使用上面的工具欄進行調解。將您的鼠標指向每個圖標，Quantity?One就會知道彈出壹個黃色的提示信息告訴您這個按鈕的功能。在此不再繼續闡述了。
9?Quantity?One的電泳條帶分析功能---高斯建模與結果分析
現在我們已經完成了泳道識別、背景去除、條帶識別的任務。接下來我們要對Bands進行壹些處理，然後就可以進行最終的結果分析了。
高斯建模：大家學過統計學知識後都知道高斯（Gauss）分布是個什麽意思，在此我就不多作解釋了。Quantity?One認為壹個理想狀態的Band內部的光密度分布應該也服從高斯曲線的特征，正如前面向大家展示的3D?Viewer中的圖片那樣。在我們日常的電泳泳道中經常出現幾個相隔很近的Bands（即分子量很接近的幾個蛋白或者核酸）在泳道的某個區域成串出現。此時我們很難通過會自等高線的辦法精確的描繪出每條Band獨立的輪廓。這個時候我們就需要對這些擁擠在壹起的Bands進行高斯建模處理。Quantity?One能夠依據高斯曲線的特征，配合有效的背景去除，將各條緊靠在壹起、邊界相互融合的Bands描繪成具有獨立光密度分布的相互重疊的曲線。如下圖所示，原來相互融合的22、23兩條Bands經過高斯建模之後變成了兩個具有獨立分布曲線，相互重疊的Bands。
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高斯建模必須建立在有效的泳道背景去除之後。背景去除的方法可以參見我們前面的方法，即通過“Lane-Lane?Backgrouds”的方式進行去除背景。去除背景的時候最好選擇Rolling?Disk?Size小壹些的方案。這樣背景去除後的光密度分布曲線和高斯建模後的光密度分布曲線才能比較好的吻合。另外高斯建模並不是壹個必須的步驟。它僅僅在出現多條Bands緊密排列在壹起，以至於無法分辨它們之間的間隔的時候才最有效。如果Bands在泳道上松散的分布則可以不使用高斯建模.
那麽如何進行高斯建模呢？很簡單！只要執行“Band-Gauss?Model?Bands...”命令就可以，執行後Quantity?One回彈出壹個對話框問您要對那條泳道進行高斯建模。請鉤選“One”，然後再輸入需要建模的泳道代碼就可以了（比如下圖中的第2泳道）；如果選擇了“All”則對所有泳道進行高斯建模，當然建模這麽多泳道會費壹點時間了。
觀察結果：執行完高斯建模以後使用“Band-Band?Information”命令來觀察結果。方法是將變成藍色驚嘆號的鼠標移到剛才已經識別的Band的部位，壹個詳細的“Band?Information”信息框就會立刻彈出來（見下圖）。在這幅圖中我們必須註意的是“Trace”和/或“Gauss?Model?Trace”，因為我們剛才辛苦了半天就是為了得到這個數據。這個數據表示的就是Band光密度分布曲線下面積，也就是Quantity?One用來表達Band內分子總量的方式。在這個信息框中還有壹些重要信息比如“Mol?Wt”（分子量）；“Quantity/Units”等現在還是空白，咱們下以後的分析步驟中將逐漸填滿它們。
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Quantity?One有壹點讓人感到很不明白。它的“Trace”和“Gauss?Model?Trace”都是表示曲線下面積的，可是使用的單位是OD*mm；而在另外的等高線定量方法中，同樣是表示某個區域面積的單位卻是OD*mm2.
下面讓我們回過頭來看看高斯建模之後電泳圖片的分析結果到底發生了什麽變化。首先是壹張沒有進行高斯建模的圖片，大家可以看到在這張圖片中的白框部分，第2泳道的第6個band的光密度曲線黃色部分並不呈高斯對稱（少了壹部分不是？）。這是因為它壹部分和鄰近的Band相互融合在壹起了。
現在再來對比壹下經過高斯建模後的電泳圖片分析結果。還是在相同位置，這時代表第2泳道第6個Band的黃色光密度曲線是不是呈完整的高斯對稱了？而且後面的“Gauss?Model?Trace”也不再是“N.A”，而變成了“0.717?OD”，對比上面的“Trace”=0.693?OD，大家想想為什麽要大壹些呢？
10?Quantity?One的電泳條帶分析功能---分子量預測
前面我們和大家學習了用Quantity?One進行電泳條帶定量的基本方法。現在我們暫時轉移視線來探討壹下另壹個功能，分子量預測。這個功能對於蛋白質而言是分子量預測，對於核酸而言就是核酸大小的預測了。下面我們還是以蛋白質為例來學習。
分子量預測：首先大家必須知道的是分子量的預測是建立在泳道和條帶都已經創建好的基礎上。我們只是人為的為壹些泳道上的條帶加上壹個已知的標準，然後通過不同泳道和條帶之間的對比繪制回歸曲線，通過回歸曲線的走向來預測特定條帶上的分子的分子量。當然如果我們能夠在壹次電泳中多跑幾條不同分子量成分的marker，必然能夠提高我們預測的準確性。
下面我們談談如何操作。在已經創建好泳道和條帶的圖片上，執行“Match-Standard”命令，在彈出的“Select?Standards”選項卡中選擇壹個合適的marker。如果您自己已經跑了Marker，那麽請選擇“New?Standard”創建您自己的marker，然後在彈出的“Standard”菜單中輸入您的Marker的分子量。如下圖在“Standard”中輸入壹個名稱，然後在下面的表格中輸入各個Marker的分子量和名稱。
輸入完成以後用鼠標點擊“Type”下面的小箭頭（上圖鼠標指向的位置），然後把變成綠色加號的鼠標移動到您的Marker泳道上相應的band。例如上圖中200KD就移動到第15泳道的200KD的位置，以此類推，將每個Marker都標記上相應的數字。標記完成後，Maker泳道上的Bands就會變成藍色。
如果您有多條Marker泳道，您可以再多表記幾條以提高軟件預測的準確性。現在我們執行“Match-Standard?Curve”，然後用鼠標隨便點擊我們想要了解的泳道，Quantity?One立刻就會為我們顯示出壹條曲線，傍邊還有壹個小的對話框“Std.Curve?Options?for?Proteins”，在這個對話框中“Regression?Model”選擇“Point?to?Point?Semi-log”或者“Elder-Southern”這兩種回歸方式；然後鉤選傍邊的“Show?Numerical?data?of?Points”，這時再看那條曲線上是不是已經標註了