限制性片段分析需要用什麽方法

1.PCR擴增：PCR反應體系為20μl，含模板2μl(約50ng)，引物各1.6μl，dNTP1.6μl(0.4mM)，10×Buffer緩沖液2μl，Taq酶0.5U，加雙蒸水至20.0μl；PCR反應條件為95℃2min，94℃30sec/64℃30sec/72℃30sec(5個循環)，94℃30sec/63℃30sec/72℃30sec(5個循環)，94℃30sec/60℃30sec/72℃25sec(23個循環)，94℃30sec/60℃30sec/72℃1min。

2.PCR 擴增產物的檢測：取PCR 擴增產物2μl，以1%的瓊脂糖凝膠潛水電泳法檢測靶DNA 片段的擴增產物。

3.酶消化反應：取PCR 產物約2.0μl，加限制性內切酶BstN I1U，10×酶消化反應緩沖液1.0μl，蒸溜水補至10.0μl 置試驗管中。37℃溫箱中孵育4h。

4.酶切產物電泳分型：6%聚丙烯酰胺凝膠電泳（T=6%，C=3.3%，凝膠規格為82mm×64mm×0.75mm）。電極緩沖液為1×TBE。將加有1/5 體積上樣緩沖液的酶切產物電泳，220 v 電壓，電泳2－3h。

5.銀染顯色將凝膠剝離至染色盤中，用10%冰醋酸固定30min,去除固定液，用蒸餾水沖洗凝膠3 次（2min 以內）。將0.1%硝酸銀溶液200ml 倒入染色盤中，染色30min，倒掉染色液，蒸餾水快速沖洗凝膠1 次（20s 以內）。顯色液200ml（3% Na2CO3，含0.05%甲醛，2‰Na2S2O3）倒入染色盤中，不斷震蕩，直至譜帶顯示清晰。用固定液終止顯色。蒸餾水洗滌壹次，貼於濾紙上晾幹保存。