1 控制端粒延長靶點的物質?
目前對端粒的研究表明，端粒是真核生物染色體末端的特殊結構，包含若幹的DNA雙鏈重復序列，其末端為含多個G的單鏈DNA. 不同物種端粒的重復序列和長度是不壹樣的，但每種生物體有其特定的序列和平均長度〔如人的端粒為(TTAGGG)n，大約在?15kb?左右〕. 此外，端粒DNA上還結合有蛋白質，有兩種結合形式：壹種是結合於單鏈DNA；另壹種則與端粒雙鏈進行結合. 前者在端粒末端提供帽狀結構以穩定端粒；後者可能直接參與端粒長度平衡的維持，是端粒延伸的負調節因子〔1〕. 目前所分離到的人端粒結合蛋白hTRF是壹種雙鏈結合蛋白，它參與維持端粒長度的穩定〔2〕. 改變端粒結構和功能的抑制劑介紹如下.?
1.1 改變端粒結構導致的端粒酶活性失常 端粒是由大量串聯的重復序列組成的，其中壹條鏈富含G，另壹條富含C. 端粒合成時先由端粒酶將端粒重復序列加到富G鏈上去，再由DNA聚合酶合成富C鏈. 不同生物的端粒G鏈壹般都采用緊實結構. 而在所有的結構中，G-四聯體是理論上最穩定的結構，它除了可在兩條DNA分子間形成外，還可以在含四段重復端粒序列單鏈DNA中形成. Zahler ?et al〔3〕考察了端粒DNA的不同折疊方式作為引物時對四膜蟲端粒酶的影響. 他們發現端粒G-四聯體結構啟動端粒酶延伸端粒的效率最差，不能作為端粒酶的引物，另外，他們的進壹步研究發現，端粒酶所需的引物可能不應有任何折疊. 折疊的端粒DNA結構由於無法作為引物與端粒酶RNA組分堿基配對、結合，或者改變了端粒引物從端粒酶解離的速度而影響端粒的延伸. 目前，所有已知生物的端粒都是在富G的那條鏈上由端粒酶進行端粒合成，因此，能促使或穩定端粒形成G-四聯體結構的物質可能對癌癥有潛在治療意義. 在Zahler ?et al〔3〕?的報道中指出體外生理濃度(?20mmol/L?)下的K+、Na+離子可以形成穩定G-四聯體結構，以前者的效果更明顯. Sun ?et al〔4〕?應用經典的引物端粒酶延伸技術為手段進行實驗，發現小分子化合物2，6—二酰胺蒽醌能抑制端粒酶活性，其IC50為?23μmol/L?，在約?100μmol/L?時幾乎可以完全抑制端粒酶活性 他們用UV(ultraviolet spectroscopy)和1H-NMR(1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy)檢測滴定結果，證明了該種物質對端粒酶的抑制是與端粒G-四聯體結構直接相關的. 與此有關的細胞內抑制端粒酶作用正在研究之中. Fedoroff ?et al〔5〕?也采用NMR的方法進行研究，報道了3，4，9，10-perylenetetracarboxylic diimide-based化合物結合G-四聯體結構從而抑制端粒酶活性. 另外，Burger ?et al〔6〕最新的研究表明，早已被應用於臨床的抗癌藥物順鉑也是壹種序列專壹性的G-Pt-G交聯劑，研究發現順鉑能抑制人睪丸腫瘤細胞中的端粒酶活性，這可能正是順鉑能有效治療多種腫瘤的原因之壹. 類似化合物還有炭花青Carbocynamine.?
1.2 端粒結合蛋白與端粒活性抑制 關於端粒的延伸、加工機制有多種不同的假設模型，無論哪壹種都認為，端粒結合蛋白(telomere binding proteins, TBPs)及其他壹些附屬因子在端粒長度的調節中起著不可或缺的作用. 它們或者通過影響端粒酶活性，或者通過直接對端粒進行加工、剪切來***同完成對端粒長度的調節〔1〕. 在對四膜蟲單鏈TBPs的研究過程中發現，該α/β異二聚體蛋白質中α，β蛋白在體內都是磷酸化的；體外研究也表明，β亞基的磷酸化是隨細胞周期而調節的. 這壹磷酸化機制很可能在端粒酶延伸端粒的過程中起作用〔1〕. 另外，酵母的Rapl是目前研究最深入的壹種端粒雙鏈TBP，它在端粒的長度調節機制中的作用十分復雜，是通過與其他壹些蛋白的相互作用來完成的〔1〕. 因此，設想以TBPs為靶點，通過抑制或調節TBPs及相關因子的活性來抑制端粒酶，縮短端粒，從而使腫瘤細胞死亡. 但目前尚未有關於人端粒結合蛋白特異性抑制物的報道.?
2 抑制端粒酶結構和功能靶點的物質?
端粒酶是壹種核糖核酸蛋白質復合物. 其RNA組分為端粒合成提供模板. 現認為，人的端粒酶RNA分為兩個區與引物作用：壹個是模板區，含有與引物互補的11個核苷酸5’-(CUAACCCUAAC)-3’；另壹個是錨定區，與引物的5’端相連，為DNA鏈向端粒酶外延伸提供路徑〔7〕，而端粒酶中的蛋白質則起催化反應合成的作用. 目前分離的人端粒酶蛋白質有兩種，TPl含2627個氨基酸〔8〕，可能介導端粒酶與端粒之間的相互作用；另壹種是hEST2p，它可能是人端粒酶的催化亞基，對端粒酶活性的表達、調節具有重要意義〔9〕.?
2.1 針對端粒酶RNA模板抑制端粒酶活性 Kanazawa ?et al〔10〕制備了以端粒酶RNA組分為靶點的榔頭樣核酶TeloRZ(a hammered ribozyme)，試圖通過實驗搞清楚它是否可以抑制端粒酶. 結果表明：TeloRZ對他們所合成的含端粒酶RNA組分的壹段核苷酸具有專壹的剪切能力，它能在模板區的第壹個5’-C↓U處剪切多核苷酸. 將TeloRZ加入到肝癌細胞株HepG2或Huh-7細胞提取物中，對兩者的端粒酶均起抑制作用，且與劑量成正相關，在大約?10μmol/L?時就可以抑制大約90%的端粒酶活性. 另外，Wan ?et al〔11〕?報道了具有更高生物穩定性的2’-O-甲基化榔頭樣核酶能在大約?0.4μmol/L?時抑制人神經膠質瘤U87-MG細胞中90%的端粒酶活性. 能降解端粒酶RNA組分的核酶有希望成為壹種抗癌新藥物.?
Feng ?et al〔12〕在體外采用了與模板區互補的反義寡核苷酸來抑制端粒酶活性. 轉染了反義hTR(human telomerase RNA)的HeLa細胞在經過23～26代倍增後，大部分細胞株(33株中的28株)進入危機期，端粒酶活性受到抑制，細胞開始死亡. Norton ?et al〔13〕?設計了針對人端粒酶RNA模板區的反義硫代寡核苷酸(PS)和肽核苷酸(PNA)，PNA能專壹識別結合人端粒酶，並在從?P mol/L～n mol/L?的範圍內達到IC50的抑制活性. 他們的實驗證明PNA對端粒酶活性的抑制效力比其類似物硫代寡核苷酸PS高出10～50倍；而且後者對端粒酶是非序列選擇性抑制，PNA對端粒酶抑制則是高專壹性的. 最近，Pitts ?et al〔14〕?則發現2’-O-甲基RNA能對細胞培養和實驗動物產生專壹性的影響，其抑制端粒酶的作用要超過肽核苷酸PNA. Glukhov ?et al〔15〕?以黑色素瘤細胞株SK-Mel-28為對象，研究認為：互補於hTR模板區的反義核苷酸對端粒酶活性的抑制強於其他反義核苷酸，在?5nmol/L?時即可產生強烈抑制，而?20nmol/L?的樣品可以完全抑制端粒酶活性. 這些研究結果顯示了hTR反義寡核苷酸的良好應用前景.?
2.2 針對端粒酶的逆轉錄酶性質抑制端粒酶活性 端粒酶實際上是壹種特殊的專壹逆轉錄酶. Strahl ?et al〔16〕?以人B細胞系的JY616細胞和T細胞系的Jurkat E6-1細胞(這兩種細胞均表現端粒酶活性)為研究對象，考察已知的反轉錄病毒逆轉錄酶抑制劑是否會影響這些細胞的端粒長度和培養時的生長速率. 實驗表明，ddG可以使分裂細胞的端粒發生復制性的逐漸縮短，並穩定在較短狀態. azidothymidine (AZT)也可以使部分細胞的端粒逐漸縮短. Yegorov ?et al〔17〕?的類似實驗表明，在逆轉錄酶抑制劑AZT和Carbovir存在下，鼠的胚胎成纖維細胞可以自發轉化形成無端粒酶的克隆，發生類似於衰老的過程. 但這壹抑制過程是可逆的，AZT，ddG這些逆轉錄酶抑制劑可能是通過優先占據端粒酶的核苷酸結合位點而抑制了端粒合成.?
2.3 針對端粒酶促反應底物抑制端粒酶活性 端粒酶作為壹種末端轉移酶，它把脫氧核苷酸加到端粒的末端上從而延長端粒. Fletcher ?et al〔18〕?的實驗表明7-脫氮-dGTP和7-脫氮-dATP會抑制端粒酶活性. 7-脫氮-dGTP和7-脫氮-dATP分別在?11μmol/L?和?8μmol/L?時可以抑制人胚腎293細胞株中50%的端粒酶活性 二者可以被端粒酶加入到端粒DNA中去，但因不是端粒酶的正確、高效底物而抑制了端粒酶的活性，導致端粒提前成熟(pre-maturing)，表現為縮短的端粒，提示N?7對於端粒酶活性可能是必須的. 這壹模型可以用來研究DNA二級結構在端粒酶機制中的作用，同時又為設計新的端粒酶抑制劑提供了壹個可供參考的思路.?
2.4 針對端粒酶的DNA錨著區抑制端粒酶活性 端粒酶以錨著區與作為引物的端粒DNA的5’端結合，繼而延伸端粒. 通過破壞端粒酶的DNA錨著區可抑制端粒酶進行端粒合成，使腫瘤細胞端粒縮短而死亡〔19〕. 但目前尚末有關於此類物質的報道.?
2.5 磷酸酯酶2A對端粒酶活性的抑制 Li ?et al〔20〕以人乳腺癌細胞PMC42為研究材料，發現磷酸酯酶2A(PP2A)與受試腫瘤細胞核提取物***溫育時能夠顯著抑制其端粒酶活性. 這種效應呈濃度依賴性(ED50為?10U?±?2U?)，並且非常迅速(?10s?即出現顯著抑制，2min時出現完全抑制). 但PP2A與受試細胞膜提取物***溫育時對其端粒酶活性的抑制稍弱壹些，與細胞質***溫育時則基本不抑制其端粒酶活性. 此外，PP2A對核端粒酶活性的抑制作用可能是專壹的，因為蛋白磷酸酯酶1或2B都不影響端粒酶活性. Li ?et al?用PP2A的催化抑制劑okadaic acid證明了PP2A誘導的端粒酶抑制是與蛋白去磷酸化有關的. 最近Sogawa ?et al〔21〕發現了壹種從海洋微球藻中分離出來的胞外多糖也具有抑制K562細胞中端粒酶活性的能力，實驗表明，當K562細胞與該多糖***培養時，蛋白磷酸酯酶1的催化亞基PP1γ1的表達下降. 這些實驗表明，某些端粒酶的蛋白質組分或端粒酶調節因子的磷酸化、去磷酸化對於癌癥細胞的端粒合成是具有重要意義的.?
2.6 PKC抑制劑對端粒酶活性的抑制 Ku ?et al〔22〕?以培養的鼻咽癌細胞NPC-076為研究對象，發現有2種蛋白激酶(PKC)抑制劑bisindoplylmaleimideⅠ和H-7能夠顯著抑制受試細胞中的端粒酶活性；而另外2種PKC抑制劑中，Staurosporine能中度抑制端粒酶活性，神經鞘氨醇則僅輕微抑制. 此外，在實驗中還觀察到，處理後的細胞大部分仍是可養活的(超過75%)，且維持了相當高水平的蛋白質合成能力. 這壹發現為研究端粒酶機制以及癌癥的端粒酶療法提供了新的思路.?
2.7 壹些小分子化合物對端粒酶活性的抑制 Perry ?et al〔23〕?報道了1，4-和2，6-雙取代氨基蒽-9，10-dione衍生物對端粒酶和Taq酶活性的抑制，如氮己環抑制端粒酶活性的IC50值為?4μmol/L?～?11μmol/L?，它在目前已知的非核酸端粒酶抑制劑中顯示出較強效力. 另外，Maasani ?et al〔24〕的實驗表明，茶葉中的主要兒茶酚(catechin)成分—epigallocatechin的沒食子酸鹽能夠直接強烈抑制端粒酶活性，這可能是茶葉抗癌效果的主要機制之壹. Bare ?et al〔25〕?以銪標記探針和瞬時熒光(time-resolved fluorescence)的新方法對125000種化合物進行篩選，確定了壹系列含isothiazolone的端粒酶抑制劑，其中最具效力的物質在次微摩爾水平就可達IC50值. 最近的研究還表明DMSO能可逆抑制端粒酶活性.?
3 結語?
端粒、端粒酶已成為當今最引人註目的抗腫瘤治療新靶點之壹，近來的壹些研究表明，端粒酶抑制劑不但可以直接導致腫瘤細胞的死亡，還可以提高腫瘤細胞對破壞DNA的抗腫瘤藥的敏感性以及對雕亡的感受性(U251-MG細胞)〔26〕，這壹結果使得端粒酶抑制劑的應用前景更加看好. 雖然對於這種療法並非全無顧慮，比方說擔心端粒酶抑制劑會對幹細胞和生殖細胞造成不利影響，以及擔心端粒酶抑制劑的使用可能會誘發非端粒酶的端粒延長途徑等. 但就目前的知識來看，對前者的憂慮可以通過設計療程而得到某種程度的避免(但也有個別報道說腫瘤細胞的端粒並不都比幹細胞短)，而對後者的擔心則還需通過實驗的證明以及進壹步的實驗來解決.?
可以肯定的是，對端粒酶抑制劑的尋找和研究工作要依賴於對端粒、端粒酶的研究. 伴隨著對端粒、端粒酶結構功能和調節機制研究的不斷深入，對端粒酶抑制劑的研究也壹定會越來越深入. 但從目前的研究來看，對端粒酶抑制劑的研究大多尚處於體外細胞實驗階段，體內藥理作用及藥代動力學情況究竟如何鮮有報道. 端粒酶抑制劑應用於臨床時的效果及毒副作用也還需要事實的進壹步驗證.