1)24孔板內以5~8 x 104 cells/孔的密度鋪板,鋪足夠量的孔以進行後續的梯度實驗。細胞孵育過夜;
(2)準備篩選培養基-含不同濃度嘌呤黴素的新鮮培養基(如0-15μg/mL,至少5個梯度); (3)細胞孵育過夜後加入篩選培養基,孵育細胞; (4)約2-3天更換新鮮的篩選培養基;
(5)每日監測細胞觀察存活細胞比例。嘌呤黴素的最佳作用時間壹般在1-4天之間。
(6)最小的抗生素使用濃度就是指從抗生素篩選開始1-4天內殺死所用細胞的最低篩選濃度。
嘌呤黴素篩選穩定轉染細胞
(1)day 0:24孔板內以5~8 x 104 cells/孔的密度鋪板,孵育過夜;
(2)制備篩選培養基:含有最佳篩選濃度嘌呤黴素(由殺滅曲線確定)的新鮮培養基;
(3)day 1:篩選第壹天,去除舊的培養基,加入壹定量MOI的病毒顆粒;(加入無血清培養基的總量必須充分覆蓋住細胞。)
(4)病毒轉導後約6-8h,再添加1ml完全培養基(血清和雙抗,如果已經使用雙抗。)到細胞內,然後孵育過夜;
(5)病毒轉導後48h,使用嘌呤黴素篩選培養基替換舊的完全培養基。孵育。 (6)約每2-3天替換新鮮配制的篩選培養基;
(7)每天檢測細胞並觀察活細胞生長比例,以及turboGFP表達的水平及所占比例。在某壹個時間點幾乎所用存活細胞都可以表達TurboGFP。嘌呤黴素最佳的作用時間在3-10天之間。
註:病毒的MOI越高,每個細胞含有的shRNA拷貝和嘌呤黴素耐性基因越多。在做嘌呤黴素篩選時,需記住越高MOI,含越多pac拷貝的細胞能耐受更高的嘌呤黴素濃度。調整嘌呤黴素的濃度去篩選預定量的轉導細胞,但是嘌呤黴素的量不能低於殺死曲線建立的最低濃度