丙酮酸羧化酶的變構激活劑是乙酰CoA。
丙酮酸羧化酶的變構激活劑，在糖異生過程中，有4個酶被調節，即丙酮酸羧化酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、果糖二磷酸酶和葡萄糖磷酸酶。丙酮酸羧化酶的變構激動劑是乙酰CoA。乙酰CoA在線粒體內增加丙酮酸羧化酶的活性，進而增加了檸檬酸的合成。
丙酮酸羧化酶EC6．4．1．1．丙酮酸+CO2+ATP+H2O→草酰乙酸+ADP+Pi，ΔGo′=-0.5kcal．廣泛存在於動物、黴菌和酵母中，但在植物體和大部分細菌中卻不含此酶。在三羧酸循環中，它是供給草酰乙酸的主要補充反應。
丙酮酸羧化酶為壹種變構酶，有乙酰CoA時，其活性存在，同時含有生物素作為和CO2反應的酶的輔酶。分子量約65萬，有很多亞基。最適pH為4.8。
從小牛肝臟分離出來的丙酮酸羧化酶分子量為655 000，並含有錳(Ⅱ)和鎂(Ⅱ)離子，但比例並不恒定，說明兩種金屬離子在酶分子中可以互相替代。由老鼠肝臟、火雞和雞肝臟得到的丙酮酸羧化酶只含錳(Ⅱ)離子，如果在雞的飲食中缺乏錳元素時，則可得到只含鎂的酶。需要生物素和乙酰輔酶A作為它的輔酶。丙酮酸羧化酶可以催化二氧化碳固定在丙酮酸上，生成草酰酸。