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光學顯微鏡的性能參數有哪些?這些參數間的影響和制約關系如何

壹、數值孔徑

數值孔徑簡寫NA,數值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術參數,是判斷兩者(尤其對物鏡而言)性能高低的重要標誌。其數值的大小,分別標刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。

數值孔徑(NA)是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質的折射率(n)和孔徑角(u)半數的正弦之乘積。用公式表示如下:NA=nsinu/2

孔徑角又稱"鏡口角",是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度。孔徑角越大,進入物鏡的光通亮就越大,它與物鏡的有效直徑成正比,與焦點的距離成反比。

顯微鏡觀察時,若想增大NA值,孔徑角是無法增大的,唯壹的辦法是增大介質的折射率n值。基於這壹原理,就產生了水浸物鏡和油浸物鏡,因介質的折射率n值大於1,NA值就能大於1。

數值孔徑最大值為1.4,這個數值在理論上和技術上都達到了極限。目前,有用折射率高的溴萘作介質,溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大於1.4。

這裏必須指出,為了充分發揮物鏡數值孔徑的作用,在觀察時,聚光鏡的NA值應等於或略大於物鏡的NA值。

數值孔徑與其他技術參數有著密切的關系,它幾乎決定和影響著其他各項技術參數。它與分辨率成正比,與放大率成正比,與焦深成反比,NA值增大,視場寬度與工作距離都會相應地變小。

二、分辨率

顯微鏡的分辨率指能被顯微鏡清晰區分的兩個物點的最小間距,又稱“鑒別率”。其計算公式是σ=λ/NA

式中σ為最小分辨距離;λ為光線的波長;NA為物鏡的數值孔徑。可見物鏡的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。NA值越大,照明光線波長越短,則σ值越小,分辨率就越高。

要提高分辨率,即減小σ值,可采取以下措施:

1、降低波長λ值,使用短波長光源。

2、增大介質n值以提高NA值(NA=nsinu/2)。

3、增大孔徑角u值以提高NA值。

4、增加明暗反差。

三、放大率和有效放大率

由於經過物鏡和目鏡的兩次放大,所以顯微鏡總的放大率Γ應該是物鏡放大率β和目鏡放大率Γ1的乘積:

Γ=βΓ1

顯然,和放大鏡相比,顯微鏡可以具有高得多的放大率,並且通過調換不同放大率的物鏡和目鏡,能夠方便地改變顯微鏡的放大率。

放大率也是顯微鏡的重要參數,但也不能盲目相信放大率越高越好。顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。

分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯系的概念。有關系式:500NA<Γ<1000NA

當選用的物鏡數值孔徑不夠大,即分辨率不夠高時,顯微鏡不能分清物體的微細結構,此時即使過度地增大放大倍率,得到的也只能是壹個輪廓雖大但細節不清的圖像,稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足,則顯微鏡雖已具備分辨的能力,但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發揮顯微鏡的分辨能力,應使數值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。

四、焦深

焦深為焦點深度的簡稱,即在使用顯微鏡時,當焦點對準某壹物體時,不僅位於該點平面上的各點都可以看清楚,而且在此平面的上下壹定厚度內,也能看得清楚,這個清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被檢物體的全層,而焦深小,則只能看到被檢物體的壹薄層,焦深與其他技術參數有以下關系:

1、焦深與總放大倍數及物鏡的數值孔徑成反比。

2、焦深大,分辨率降低。

由於低倍物鏡的景深較大,所以在低倍物鏡照相時造成困難。在顯微照相時將詳細介紹。

五、視場直徑(FieldOfView)

觀察顯微鏡時,所看到的明亮的圓形範圍叫視場,它的大小是由目鏡裏的視場光闌決定的。

視場直徑也稱視場寬度,是指在顯微鏡下看到的圓形視場內所能容納被檢物體的實際範圍。視場直徑愈大,愈便於觀察。

有公式:

F=FN/β

式中F-視場直徑;

FN-視場數(FieldNumber,簡寫為FN,標刻在目鏡的鏡筒外側);

β-物鏡放大率。

由公式可看出:

1、視場直徑與視場數成正比。

2、增大物鏡的倍數,則視場直徑減小。因此,若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌,而換成高倍物鏡,就只能看到被檢物體的很小壹部份。

六、覆蓋差?

顯微鏡的光學系統也包括蓋玻片在內。由於蓋玻片的厚度不標準,光線從蓋玻片進入空氣產生折射後的光路發生了改變,從而產生了相差,這就是覆蓋差。覆蓋差的產生影響了顯微鏡的成響質量。

國際上規定,蓋玻片的標準厚度為0.17mm,許可範圍在0.16-0.18mm,在物鏡的制造上已將此厚度範圍的相差計算在內。物鏡外殼上標的0.17,即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。

七、工作距離WD

工作距離也叫物距,即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時,被檢物體應處在物鏡的壹倍至二倍焦距之間。因此,它與焦距是兩個概念,平時習慣所說的調焦,實際上是調節工作距離。

在物鏡數值孔徑壹定的情況下,工作距離短孔徑角則大。

數值孔徑大的高倍物鏡,其工作距離小